四君子汤改善C57小鼠恶病质状态肌肉消耗的疗效及机制研究

朱健 吉兆奕 焦拥政 朱晓云 曹 袁国兴 吴洁

恶病质是各种恶性肿瘤尤其是晚期患者的主要并发症，是造成死亡的独立危险因素，严重影响患者的生存期及生活质量，预后差[1]。晚期肿瘤患者约50%～80%存在厌食和体重下降等恶病质的表现[2]，且进行性的肿瘤恶病质状态预后不佳，存活时间短，占所有癌症死亡的近20%[3]。目前临床尚缺乏合理的治疗策略，尚无单一性、特异性的疗效确切的药物[4]。

中医学虽无恶病质病名，但其以纳呆食少、倦怠乏力、消瘦等一系列脏腑虚损症状为主要临床表现，属于中医“虚劳”范畴[5]。中医认为脾为后天之本、气血生化之源，从脾论治虚劳最早见于《金匮要略》，而脾虚也是肿瘤发病的基础[6]。四君子汤是中医治疗脾胃气虚的经典方剂，近年研究文献提示四君子能够改善肿瘤恶病质状态，与抑制炎症因子有关[7]，而具体机制未详细阐明。基于此，本课题组建立C57小鼠肺癌恶病质模型，观察四君子汤改善C57小鼠恶病质状态肌肉消耗的疗效及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级近交系6～7周C57BL/6小鼠24只，雌雄各半，体质量18～24 g，购自中国中医科学院药品鉴定所实验动物中心(动物许可证号：SCXK京20000010号)。

1.2 细胞株及种瘤方法

Lewis鼠源肺癌细胞由中国医学科学院基础医学研究所细胞中心提供。癌细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37℃、5%CO2培养箱内培养，定期更换，约3～4日待细胞铺满瓶底胰酶消化后，用PBS配置为1×107/mL细胞悬液。使用随机数字表法选取18只小鼠，采用1 mL注射器抽取0.2 mL细胞悬液注入小鼠右腋皮下，7天后皮下可触及瘤体，成瘤18只。

1.3 实验药物

四君子汤组方为：党参、白术、茯苓、甘草(批号分别为：21081501、21100904、21072002、21082301，均由康美智慧药房连锁有限公司提供)，以9∶9∶9∶6配比，药材由中国中医科学院广安门医院中药房提供并煎汤取汁。醋酸甲地孕酮分散片(青岛国海生物制药有限公司，规格：40 mg，生产批号：16110502)，研磨杵研磨药片，生理盐水溶解，按照0.024 g/kg给药。

1.4 主要试剂与仪器

兔来源一抗Activin-A、Myostatin、MuRF1及二抗均购于中国ABclonal公司(生产批号：RP02516、A6913、A3101)，Western Blot相关试剂盒购于中国Solarbio公司(生产批号：P1200、P1010)，人活化素A(Activin-A)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒分别购于上海远慕生物科技有限公司、武汉云克隆科技股份有限公司(生产批号：YM-1058B、SEA133Ra)。

1.5 实验方法

按照随机数字表将上述成模的18只小鼠再次分为模型组、四君子组、地屈孕酮组，每组6只。此外，正常组为6只。其中四君子组以5倍临床等效剂量，从接种第2日起开始灌胃，药物浓度1 g/mL，每日1次灌胃，每次0.3 mL；模型组与正常组自接种第2日开始给予同等剂量的生理盐水灌胃；地屈孕酮组从接种第2日开始每天给予甲地孕酮溶液，按照0.024 g/(kg·d)给药，每天灌胃1次。

1.6 检测指标

1.6.1 动态观察小鼠进食量和体质量 给药2周后处死动物，眼球取血，分离血清，解剖留取动物皮下肿瘤、脾脏、肝脏、腓肠肌标本，游标卡尺测量肿瘤长短径，并称取质量，计算肿瘤及脏器指数(脏器质量/体质量)。

1.6.2 透射电镜观察肌纤维形态 取1 cm3骨骼肌组织若干块，经过乙醇梯度脱水、包埋切片染色等处理，置于JEOL-3010透射电子显微镜下观察骨骼肌结构，并用相机记录。

1.6.3 检测血液中炎症因子水平 采用双抗体夹心酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测血清TNF-α、Activin-A水平，按ELISA试剂盒说明书操作。

1.6.4 蛋白免疫印迹(Western Blot)法及实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)肌萎缩基因Myostatin、Activin-A、MuRF-1表达水平 取恶病质小鼠骨骼肌组织2 mm3，加入裂解液及蛋白磷酸酶抑制剂，于超声匀浆中提取蛋白，在4℃，12 000r/min条件下离心5分钟，取上清后使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。经过SDS-PAGE电泳转至PVDF膜，加入抗体Myostatin、Activin-A、MuRF-1，4℃条件下孵育过夜，在漂洗、二抗孵育、洗膜等操作后，将PVDF膜浸泡于电化学发光显色成图。

取恶病质小鼠骨骼肌组织，按照10～20 mg组织加入300 μL裂解液，进行匀浆处理，按照RNA提取试剂盒的操作要求提取RNA，在纳滴仪上检测核酸浓度并确定无杂质，配置20 μL反应体系将RNA转化为cDNA，配置20 μL荧光PCR反应体系，使用StepOnePlusTMReal-TimePCRSystem型荧光定量PCR仪进行扩增，反应结束后确认扩增曲线和融解曲线，输出数据。

1.7 数据处理

2 结果

2.1 四君子汤对肺癌恶病质小鼠体质量、肿瘤直径、肿瘤质量的影响

实验发现，与模型组和地屈孕酮组相比，四君子组瘤体质量降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组肺癌恶病质小鼠体质量、肿瘤直径、肿瘤质量比较

2.2 四君子汤对肺癌恶病质小鼠脾脏、肝脏质量及脏器指数的影响

正常组无肝脾肿大现象发生，而肺癌恶病质小鼠均有肝脾肿大现象发生。在脾脏质量上，四君子组与模型组、地屈孕酮组差异无统计意义(P>0.05)。而对于肝脏质量，与四君子组相比，模型组、地屈孕酮组肝脏质量增加，差异具有统计意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组肺癌恶病质小鼠脾脏、肝脏质量及脏器指数比较

2.3 四君子汤对肺癌恶病质小鼠骨骼肌(腓肠肌、比目鱼肌、胫前肌)质量及指数的影响

对腓肠肌进行解剖、剥离、称重，发现荷瘤各组小鼠与正常组比较，肌肉质量明显降低(P<0.05)；与模型组比较，四君子汤能够改善骨骼肌的绝对质量(P<0.05)，地屈孕酮组无显著改变，四君子组较模型组骨骼肌/体质量指数有升高的趋势。见表3。

2.4 四君子汤对肺癌恶病质小鼠骨骼肌纤维形态学的影响

各组小鼠腓肠肌纤维横截面切片经苏木精—伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，在电镜下可观察到正常组小鼠腓肠肌纹路清晰，骨骼肌细胞排列紧密，呈圆形或多边形，细胞核多位于细胞周边，与细胞膜接近，细胞核被染成紫色，细胞质被染成粉红色。恶病质小鼠腓肠肌肌细胞排列疏松，肌纤维细胞缩小，细胞间隙增大，肌纤维细胞大小差异较大，说明恶病质模型的腓肠肌存在明显萎缩现象。四君子汤能明显改善骨骼肌萎缩的症状。见图1。

注：A 正常组；B 模型组；C 地屈孕酮组；D 四君子组。

表3 各组肺癌恶病质小鼠腓肠肌质量及指数比较

2.5 四君子汤对肺癌恶病质小鼠血清TNF-α、Activin-A含量的影响

恶病质模型组和四君子组小鼠血清中TNF-α含量、Activin-A较正常组明显升高(P<0.05)，提示接种肺癌细胞的各组存在血清TNF-α、Activin-A的高表达(P<0.05)。地屈孕酮组和四君子组Activin-A表达水平与模型对照组相比，存在不同程度降低(P<0.05)。见表4。

表4 各组肺癌恶病质小鼠血清TNF-α、Activin-A含量比较

2.6 四君子汤对肺癌恶病质小鼠肌萎缩相关基因表达的影响

与正常组相比，模型组腓肠肌中Activin-A、Myostatin、MuRF1的mRNA存在高表达(P<0.01)。四君子组的Activin-A表达水平与模型组相比明显降低(P<0.05)；在Myostatin表达上，地屈孕酮组和四君子组较模型组显著降低(P<0.01)；在MuRF1的表达上，四君子组与模型组相比明显降低(P<0.05)，而地屈孕酮组与模型组相比显著降低(P<0.01)。见表5。

表5 各组肺癌恶病质小鼠腓肠肌中Activin-A、Myostatin、MuRF1的mRNA表达比较

2.7 四君子汤对肺癌恶病质小鼠肌萎缩相关蛋白表达的影响

模型组小鼠肌萎缩相关蛋白Activin、Myostatin、MuRF1的表达显著升高。与模型组比较，四君子汤显著降低肌萎缩相关蛋白Activin-A的表达，结果与mRNA表达结果一致。说明四君子汤可能通过Myostatin/Actvin-ActRIIB信号途径抑制肺癌恶病质小鼠骨骼肌萎缩。而Myostatin、MuRF1蛋白表达结果与mRNA表达存在不完全一致的现象，有待进一步实验验证。见图2。

注：A 正常组；B 模型组；C 地屈孕酮组；D 四君子组

3 讨论

肿瘤恶病质是中晚期肿瘤患者的常见临床表现，以短期内体重严重下降、肌肉组织(伴或不伴脂肪组织)进行性消耗为显著特征，同时伴有厌食、水肿、贫血、多器官功能衰竭等症状，严重影响患者的生活质量，缩短患者的生存时间[4]。研究结果表明，四君子组的肿瘤平均直径相较于地屈孕酮组和模型组显著缩小，同时四君子组的腓肠肌质量相较于模型组与地屈孕酮组有一定的增加，在改善肝肿大现象上优于地屈孕酮组，在腓肠肌的电镜图上显示四君子组腓肠肌纹路相对清晰，骨骼肌细胞排列相对紧密，提示四君子汤能够在改善小鼠肿瘤恶病质方面效果优于地屈孕酮。

四君子汤改善骨骼肌萎缩症状可能通过改善小鼠静息能量消耗情况从而逆转小鼠体内能量负平衡代谢状态，一定程度上相对地提高骨骼肌质量。在能量消耗方面，人体内分为两种消耗方式，包括静息能量消耗和活动能量消耗及饮食生热。而静息能量消耗占人体消耗总能量的比值为60%～70%[8]，占人体能量消耗的主要部分。而在静息能量消耗中，又以肝脏、大脑、心脏占静息能量消耗的58%[9]，相反，骨骼肌能量消耗仅为22%[10]。肝脏是小鼠质量最大的脏器，与小鼠能量代谢和线粒体中解偶联蛋白息息相关[11]。本研究结果表明，相较于地屈孕酮，四君子组能够明显改善肝肿大现象。

四君子汤通过抗炎作用改善肿瘤恶病质骨骼肌萎缩状态。在恶病质肌肉萎缩众多调控因素中，炎性反应也起着重要的作用[12]。蛋白质的分解增加和合成减少引起骨骼肌萎缩，最终形成肿瘤恶病质，而Activin A是肿瘤患者生存期缩短的预期指标。在骨骼肌中，Activin A和Myostatin的受体activin receptor ⅡB(ActRⅡB)能够导致Smad2/3磷酸化及FOXO基因的去磷酸化，磷酸化的Smad2/3能够下调与肌肉分化相关的基因[13]，还能抑制蛋白合成途径AKT-mTOR[14]；而另一方面，磷酸化的Smad2/3和去磷酸化FOXO还能诱导MURF1和Atrogin-1基因的激活[15]，这两种蛋白能够促进骨骼肌中肌原纤维蛋白的降解，从而促进了骨骼肌的能量消耗。而TNF-α等炎症因子水平升高，也与肿瘤相关性厌食等有关[16]。研究发现肌萎缩时确实存在很多细胞因子的表达，其中TNF-α通过其信号通路可最终导致MuRF-1表达，并引起肌肉蛋白的降解[17]。TNF-α还可抑制肌肉分化生长因子mRNA水平，导致骨骼肌的分化中断，影响受损肌肉组织的修复，促进肿瘤恶病质的进展[18]。因此，Activin A和TNF-α水平的升高与肿瘤恶病质状态密切相关。四君子组小鼠血清中Activin A较模型组和地屈孕酮组明显降低，说明四君子组在降低Activin A水平方面明显优于地屈孕酮。

四君子汤通过干预Myostatin/Actvin-ActRIIB信号途径调控骨骼肌肌肉消耗。肌肉组织是人体最主要的蛋白质—能量储备库，在禁食、饥饿、各种疾病消耗状态时，机体动员蛋白质分解以应对能量需求及合成新的蛋白质。在这种代谢状态下，肌蛋白合成减少而分解增加，使机体骨骼肌肌肉量丢失，导致骨骼肌消耗。晚期肿瘤患者临床表现为体质量丢失、骨骼肌萎缩、低蛋白血症、内脏蛋白消耗、蛋白质合成减少和分解增加、蛋白转化率升高、血浆氨基酸谱异常以及机体呈现负氮平衡等，都证实骨骼肌蛋白质分解旺盛是肿瘤恶病质的主要代谢特点，骨骼肌消耗是引起肿瘤蛋白质—能量消耗性营养不良的中心环节，是最终引起恶病质的决定因素[19]。无论是临床还是实验研究，均提示多种复杂因素参与肿瘤性骨骼肌消耗，近年来比较关注基因转录和蛋白翻译水平对骨骼肌蛋白合成/分解的调控机制[20]。Myostatin/Actvin-ActRIIB信号途径是肌肉消耗的一条重要通路。MuRF1是肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶，在骨骼肌细胞核中特异表达，是蛋白质降解的相关基因，并涉及肌肉应答和收缩调节的各个方面，过度表达后在骨骼肌M线处与粗肌丝连接蛋白结合，破坏粗丝联接蛋白的亚结构域，导致粗丝联接蛋白的降解[21]。实验结果显示，在肺癌恶病质小鼠肌萎缩相关基因表达中，四君子汤能够明显降低Activin-A、Myostatin、MuRF1的mRNA表达，其中降低血清Myostatin mRNA的表达更显著。四君子汤显著降低肌萎缩相关蛋白Activin-A的表达，结果与mRNA表达结果一致。而Myostatin、MuRF1蛋白表达结果与mRNA表达存在不完全一致的现象，有待进一步实验验证。

如何预防和逆转肿瘤恶病质的发生发展，目前临床上尚缺乏有效手段。针对骨骼肌消耗性营养不良的发病机制，采取的治疗策略包括降低炎症因子和氧化应激水平，改善胰岛素抵抗，阻止caspase-3及Atrogin-1和MuRF-1的激活，降低抑制素或activin水平等。探讨肿瘤恶病质的发病机制及有效干预措施，具有十分重要的意义。本研究从Myostatin/Actvin-ActRIIB信号途径这一前沿领域，证实了四君子汤对肿瘤恶病质骨骼肌萎缩的干预作用，并能降低血清中的炎症因子，明确了四君子汤治疗肿瘤恶病质骨骼肌萎缩的关键靶点和核心通路，为应用中医药改善晚期肿瘤患者生存质量提供了生物学基础和科学理论依据。