养血安胎颗粒抑制外泌体中miR-16促进血管生成的作用研究

姚伟洁 杜博冉 李潇 冯欣

血管生成参与了妊娠的全过程。血管生成伴随着子宫和脐带血流量增加，通过提供给胎儿充足的血液，从而促进胚胎的着床与发育[1]。血管生成异常，会导致流产的风险增加[2]。陈雷宁等[3]采用三维多普勒超声发现，复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)患者的子宫内膜血管化程度与正常妊娠女性相比较显著降低，表明血管生成异常是RSA患者的病理特征。研究表明，滋养层细胞功能缺陷导致的血管生成异常被认为是RSA最重要的原因之一[4]。因此，改善胎盘血管生成可以作为治疗RSA的有效方法。

中药复方养血安胎颗粒是北京妇产医院临床应用30余年的院内制剂，在临床治疗RSA中具有确切的疗效[5-6]。研究发现养血安胎颗粒能够通过调节溶酶原活化物抑制因子-1治疗RSA[5]，而溶酶原活化物抑制因子-1是胎盘功能不全的标志，与血管生成密切相关[7]。课题组进而通过整合药理学结合Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes富集分析发现，养血安胎颗粒治疗RSA与调控血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信号通路密切相关[8]。VEGF对血管生成发挥促进作用，是重要的血管生长调节因子[9]，但是养血安胎颗粒调控VEGF的机制尚缺少深入报道。研究发现，miR-16与VEGF的3-UTR互补，进而抑制人绒毛膜滋养层细胞和人绒毛膜癌细胞(JEG-3)中的VEGF表达，从而抑制血管生成[10]。

研究发现，外泌体在滋养层细胞与子宫各种细胞的相互作用中发挥了重要的沟通作用，从而保证了血管生成和胎盘的正常发育[11]，养血安胎颗粒能否通过外泌体作为媒介调控VEGF以促进血管生成仍不清楚。故本实验以养血安胎颗粒为治疗药物，滋养层细胞和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)为研究对象，血管生成和外泌体为切入点，探讨养血安胎颗粒调控VEGF以促进血管生成的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、实验细胞及培养

20只SD雄性大鼠，鼠龄6～8周、体质量(200±20)g、购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证编号：SCXK(京)2016-0006。

人绒毛膜癌细胞(JEG-3)、人脐静脉内皮细胞(HUVECs)均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；JEG-3细胞及HUVECs均培养在25 cm2培养瓶中，使用DMEM培养基培养，培养基中含10%胎牛血清及1%青链霉素混合液，培养环境为37℃和5%二氧化碳的培养箱。

1.2 实验药物

养血安胎颗粒(8 g/袋，每g含生药3.25 g)，首都医科大学附属北京妇产医院制剂(批准文号：京药制字Z20062027；产品批号：200301Y)，由当归417 g、白芍417 g、续断417 g、桑寄生417 g、莲子417 g、菟丝子500 g、山药417 g和广木香250 g组成，煎煮并浓缩成颗粒至1000 g。

1.3 实验试剂

小鼠单克隆VEGF抗体(Santa Cruz，货号：sc-7269)，兔多克隆p-VEGFR2抗体(货号：ab194806)，兔单克隆CD9抗体(货号：ab92726)，小鼠单克隆TSG101抗体(货号：ab83)，兔多克隆Flotillin 1抗体(货号：ab41927)，小鼠单克隆β-actin抗体(货号：ab8226)，购自Abcam公司。Trizol试剂(Invitrogen，货号：223306)，TransStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金，批号：20200105)，TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(全式金，批号：20200105)，高效RIPA组织/细胞裂解液(索莱宝，批号：20200305)，超敏发光液(Millipore，批号：1907701)，BCA蛋白定量试剂盒(博奥森，批号：20190805)，CCK-8试剂盒(尚宝生物，批号：20200111)，miR-16-5p mimic、NC及转染试剂(锐博生物)。

1.4 实验仪器

超速离心机(美国Beckman公司，L-80XP)，实时荧光定量PCR仪(Bio-Rid，CFX96TM)，PowerPacTM基础电泳仪电源(Bio-Rid)，Mini-PROTEAN®Tetra电泳槽(Bio-Rid)，小型Trans-Blot®转印槽(Bio-Rid)，全波长酶标仪(Molecular Devices，SpectraMax Plus 384)。

1.5 实验方法

1.5.1 养血安胎含药血清的制备 将20只SD大鼠适应性喂养一周后，随机分为2组，每组10只，分别为空白血清组和养血安胎血清组。其中养血安胎血清组每天灌胃给予6.24 g/kg的养血安胎溶液，空白血清组每次灌胃给予等量蒸馏水。连续给药7天，末次给药1小时后处死，腹主动脉取血，静置2小时后，使用离心机在4℃，3 000r/min离心20分钟，吸取上清液，60℃灭活处理后，通过0.22 μm的微孔滤膜除菌，随后将血清分装冻存备用[12]。

1.5.2 JEG-3细胞的分组与处理 将JEG-3细胞以4×103细胞/孔的数量接种于96孔板中或4×105细胞/孔的数量接种于6孔板中并放置过夜，随后将6孔板的细胞分为4组，分别为空白对照+mimic NC组、养血安胎+mimic NC组、空白对照+miR-16 mimic组和养血安胎+miR-16 mimic组。其中空白对照+mimic NC组加入空白组血清并转染miR-16-5p mimic NC，养血安胎+mimic NC组加入养血安胎含药血清并转染miR-16-5p mimic NC，空白对照+miR-16 mimic组加入空白组血清并转染miR-16-5p mimic，养血安胎+miR-16 mimic组加入养血安胎含药血清并转染miR-16-5p mimic。72小时后收集细胞[13]。96孔板细胞分为空白对照组，1%养血安胎组、5%养血安胎组和10%养血安胎组，分别加入空白血清，1%、5%、10%含药血清。

1.5.3 外泌体的分离 通过差速离心法分离JEG-3细胞分泌的外泌体，具体方法为将培养有JEG-3细胞的培养基先后以300 g离心10分钟，2 000 g离心15分钟，10 000 g离心30分钟，随后吸取上清液并以70 000 g离心70分钟2次，得到的沉淀物为外泌体。随后使用磷酸缓冲盐溶液溶解外泌体，用于后续实验[14]。

1.5.4 HUVECs的分组与外泌体共培养 将HUVECs以4×103细胞/孔的数量接种于96孔板中或4×105细胞/孔的数量接种于6孔板中并放置过夜，将6孔板的细胞设置空白对照+mimic NC组、养血安胎+mimic NC组、空白对照+miR-16 mimic组和养血安胎+miR-16 mimic组。按1∶40 000将HUVECs分别与相应组别JEG-3细胞分泌的外泌体共培养24小时[15]。96孔板细胞分组同1.5.2。

1.6 检测指标

1.6.1 Cell Counting Kit-8(CCK-8)法测定JEG-3和HUVECs的活力 将96孔板中JEG-3细胞放置过夜后，加入不同浓度养血安胎含药血清(分别为1%、5%、10%)分别处理JEG-3细胞24小时和48小时；将96孔板中HUVECs放置过夜后，按照步骤1.5的方法处理细胞；分别在JEG-3细胞和HUVECs每孔中加入CCK-8溶液后37℃孵育3小时，使用酶标仪在490 nm处测定吸光度值。

1.6.2 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)法检测JEG-3细胞、外泌体和HUVECs中miR-16水平的变化 使用步骤1.5.2的方法处理JEG-3细胞，步骤1.5.4的方法处理HUVECs，随后收集细胞和外泌体。采用Trizol法提取细胞和外泌体中的总RNA，然后通过反转录试剂盒反转录为cDNA，进而通过SYBR预混系统和特异性引物进行RT-PCR扩增，以U6为内参，计算2-△△Ct目的基因相对表达量，结果以倍数形式表示。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物

1.6.3 蛋白质印迹(Western blot)法检测JEG-3细胞和HUVECs中VEGF和磷酸化血管内皮细胞生长因子受体2(phosphorylated VEGF receptor 2，p-VEGFR2)蛋白表达及外泌体的标记蛋白的表达 使用步骤1.5.2的方法处理JEG-3细胞，步骤1.5.4的方法处理HUVECs，随后收集细胞和外泌体。使用RIPA裂解液提取细胞中的总蛋白，并使用蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，将蛋白加入十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝中，使用电泳分离蛋白质，随后使用湿转系统将蛋白转移至0.45 μm的PVDF膜上。使用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2小时，4℃下加入相应一抗孵育过夜，回收一抗后洗膜，加入对应二抗室温孵育1小时，加入电化学发光试剂并在凝胶成像系统中形成图像。使用Image J软件计算样品灰度值，计算蛋白表达，将β-actin作为内标蛋白，结果以倍数的形式表示。一抗分别为小鼠单克隆VEGF抗体、兔多克隆p-VEGFR2抗体、兔单克隆CD9抗体、小鼠单克隆TSG101抗体、兔多克隆Flotillin 1抗体。

1.7 数据处理

2 结果

2.1 养血安胎含药血清对JEG-3细胞活力的影响

结果显示，与空白对照组、1%养血安胎组比较，24小时和48小时的5%和10%养血安胎组JEG-3细胞活力均显著升高(P<0.05)；与48小时的5%养血安胎组比较，48小时的10%养血安胎组JEG-3细胞活力进一步升高(P<0.05)，表明养血安胎含药血清能够提高JEG-3细胞的细胞增殖，后续实验选择10%含药血清干预JEG-3细胞48小时。见表2。

表2 不同浓度养血安胎含药血清在不同时间点对JEG-3细胞活力的影响

2.2 外泌体分离结果

使用超速离心法对处理后的JEG-3细胞培养基中外泌体进行分离，通过Western blot法对外泌体标记蛋白进行测定。结果显示，CD9、TSG101和Flotillin1蛋白表达呈阳性，Calnexin蛋白表达阴性，表明分离得到的物质为外泌体，且外泌体中未包含细胞碎片，纯度符合标准。见图1。

图1 Western blot法测定外泌体标志性蛋白的表达结果

2.3 外泌体对HUVECs细胞活力的影响

将外泌体与HUVECs共培养，明确其对细胞增殖的影响。结果显示，与空白对照+mimic NC组比较，miR-16 mimic来源的外泌体干预后，HUVECs细胞活力显著降低(P<0.05)；与空白对照+mimic NC组、空白对照+miR-16 mimic组比较，养血安胎来源的外泌体干预后，HUVECs细胞活力显著升高(P<0.05)，表明养血安胎能够通过外泌体对HUVECs的细胞增殖进行调节，其调节作用可能与外泌体中miR-16水平有关。见表3。

表3 不同处理组细胞的外泌体对HUVECs细胞活力的影响

2.4 养血安胎颗粒对JEG-3细胞、HUVECs及外泌体中miR-16的影响

结果显示，在JEG-3细胞中，与空白对照+mimic NC组、养血安胎+mimic NC组比较，转染miR-16 mimic后，miR-16水平均显著升高(P<0.05)，表明miR-16被成功过表达。与空白对照+mimic NC组、空白对照+miR-16 mimic组比较，使用养血安胎干预后，miR-16水平均显著降低(P<0.05)，表明养血安胎含药血清能够抑制miR-16水平。见表4。

在外泌体中，与空白对照+mimic NC组、养血安胎+mimic NC组比较，转染miR-16 mimic后，外泌体中miR-16水平均显著升高(P<0.05)；与空白对照+mimic NC组、空白对照+miR-16 mimic组比较，使用养血安胎干预后，miR-16水平均显著降低(P<0.05)，表明JEG-3细胞miR-16变化能够进一步影响其分泌的外泌体中miR-16水平。见表4。

在HUVECs中，与空白对照+mimic NC组、养血安胎+mimic NC组比较，miR-16 mimic来源的外泌体干预后，HUVECs中miR-16水平均显著升高(P<0.05)；与空白对照+mimic NC组、空白对照+miR-16 mimic组比较，养血安胎来源的外泌体干预后，HUVECs中miR-16水平均显著降低(P<0.05)，表明外泌体与HUVECs共培养后，外泌体进入HUVECs中，并影响了HUVECs中miR-16水平。见表4。

表4 养血安胎颗粒对不同组别细胞及JEG-3细胞分泌的外泌体中miR-16的影响

2.5 养血安胎颗粒对JEG-3细胞、HUVECs中VEGF、p-VEGFR2的影响

研究发现，miR-16直接靶向VEGF，进而对VEGF进行负调节。本实验结果显示，在JEG-3细胞中，与空白对照+mimic NC组、养血安胎+mimic NC组比较，转染miR-16 mimic后，JEG-3细胞中VEGF和p-VEGFR2蛋白表达均显著降低(P<0.05)，表明过表达miR-16能够抑制VEGF的表达。与空白对照+mimic NC组、空白对照+miR-16 mimic组比较，使用养血安胎干预后，VEGF和p-VEGFR2蛋白表达均显著升高(P<0.05)，VEGF对血管生成发挥促进作用，表明养血安胎能够增加VEGF表达以促进血管生成。见图2、表5。

在HUVECs中，与空白对照+mimic NC组、养血安胎+mimic NC组比较，miR-16 mimic来源的外泌体干预后，HUVECs中VEGF和p-VEGFR2蛋白表达均显著降低(P<0.05)；与空白对照+mimic NC组、空白对照+miR-16 mimic组比较，养血安胎来源的外泌体干预后，HUVECs中VEGF和p-VEGFR2蛋白表达均显著升高(P<0.05)表明外泌体通过影响HUVECs中miR-16，进而影响血管生成。见图2、表5。

注：A 空白对照+ mimic NC组; B 养血安胎+mimic NC组; C 养血安胎+miR-16 mimic组; D 养血安胎+miR-16 mimic组。

表5 养血安胎颗粒对不同组别JEG-3细胞和HUVECs中VEGF和p-VEGFR2的影响

3 讨论

RSA在中医学中属“滑胎”范畴，治疗的关键在于调补肾气，活血化瘀。近年来，以补肾活血法治疗RSA的方剂临床疗效确切，并被证明与改善血管生成相关[16-17]。养血安胎颗粒由菟丝子、续断、山药、益母草、白芍、当归、石莲子、桑寄生、广木香组成，以补肾活血为治则，诸药合用，以奏补肾健脾，养血安胎之功。其治疗RSA可能也与改善血管生成相关[8]，但目前尚未有深入的研究报道。

VEGF是重要的血管生成的调控因子，对血管生成发挥促进作用，利于胚胎着床。在妊娠过程中，胎盘组织中能够检测到VEGF蛋白和mRNA的高表达，而RSA患者血清中VEGF表达则显著降低[18]。VEGF也可通过介导VEGFR2发挥促血管生成作用，通过与VEGFR2结合，后者发生二聚化和自磷酸化，进而激活下游通路，促进细胞增殖与迁移，发挥促血管生成作用[19-21]。

miRNA能够通过调节相关血管生成蛋白表达进而导致RSA发生。研究发现，将miR-16注入妊娠小鼠胎盘，会导致小鼠胎盘异常，出现自然流产几率明显增加。此外，通过分离RSA患者的绒毛和蜕膜组织，也检测到miR-16水平相比正常妊娠女性明显增加，表明miR-16在RSA中发挥了重要的作用[10]。荧光素酶报告基因结果显示，miR-16与VEGF的3-UTR互补，通过直接靶向VEGF来负调节VEGF表达，是血管生成的新型抑制剂[10]。本实验中，为了探讨养血安胎颗粒能否提高VEGF的表达，首先通过miR-16 mimic过表达了JEG-3细胞中miR-16水平，发现JEG-3细胞中VEGF蛋白表达显著降低，也验证了miR-16能够抑制VEGF的表达。而养血安胎颗粒干预后，发现其能够抑制miR-16的水平，进而增加VEGF的表达。CCK-8实验也显示，养血安胎颗粒能够促进JEG-3细胞的增殖。以上结果表明，养血安胎颗粒具有增加VEGF表达，促进血管生成的作用。

血管生成是由蜕膜化子宫内膜细胞作用于内皮细胞以促进其增殖，迁移和侵袭产生的[22]。为了进一步研究养血安胎颗粒如何调节血管生成，课题组分离了JEG-3细胞中的外泌体。细胞外囊泡是由真核和原核细胞释放到细胞外空间的各种具有膜结构的囊泡结构统称，根据直径大小可分为外泌体、微囊泡和凋亡小体[23]。外泌体的研究目前最为广泛，其直径约40～100 nm，具有双层膜结构，内部包含多种蛋白、mRNA和miRNA等多种物质。外泌体一旦释放到细胞外空间，即可改变临近细胞活性或进入体液向远端发挥作用，通过携带来源细胞的蛋白质、mRNA和miRNA至受体细胞，进而对受体细胞功能进行调控，发挥细胞通讯作用。研究发现，外泌体能够调节血管生成，并在胚胎植入中发挥重要的通讯作用。细胞的跨膜蛋白CD9、CD63、多泡体产生的蛋白Alix和TSG101以及转膜和融合相关蛋白Flotillin 1可作为鉴定外泌体的标记物[24]。Calnexin是细胞内质网的标记蛋白，本实验中，通过Western blot法对外泌体和内质网标记蛋白进行测定，发现CD9、TSG101和Flotllin 1呈阳性表达，Calnexin蛋白呈阴性表达，表明分离得到的物质为外泌体，且不含其他细胞成分，纯度符合标准，能够用于后续实验。实验结果表明，过表达JEG-3细胞中的miR-16后，其分泌的外泌体中miR-16也同样升高；而养血安胎干预后，外泌体中的miR-16水平也得以降低。

将分离的外泌体进而与HUVECs共培养后可观察到HUVECs的细胞增殖与JEG-3细胞趋势一致，表明外泌体能够对受体细胞进行调控，且受源细胞的影响。检测与外泌体共培养后的HUVECs中miR-16水平和VEGF的蛋白表达，结果显示miR-16水平和VEGF的蛋白表达也均与JEG-3细胞的趋势相同，表明JEG-3分泌的外泌体进入HUVECs后，对HUVECs的活性进行了调节。养血安胎颗粒则通过外泌体增加了HUVECs的VEGF表达，进而发挥了促血管生成作用。

综上，养血安胎颗粒抑制JEG-3细胞外泌体中miR-16水平，进一步抑制HUVECs中的miR-16水平，进而增加HUVECs中VEGF和VEGFR2的蛋白表达，促进血管生成。