中医药调节信号通路抗肝纤维化的研究进展

刘欣灵 梁仁久 张晓梅 杜宜衡 黄贵华

肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的必经病理过程，它的发生发展主要是因为位于窦周间隙的肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)在肝细胞受到损伤时，受到多种细胞因子的刺激，合成大量的纤维状细胞外基质(extracellular matrix，ECM)。当ECM净沉积于窦周间隙中而未及时给予有效治疗，则肝纤维化会持续发展，最后变为失代偿期的肝硬化甚至肝癌。由此可见，逆转肝纤维化这一病理状态对肝硬化的治疗极具意义。

中医认为肝纤维化是由于肝病日久，机体正虚而无力抗邪，邪毒内侵，造成人体气机不畅，瘀血痰浊等病理产物阻滞于内，进而发为此病[1]。中医药多途径、多靶点、多成分的药理学特色在肝纤维化的防治中发挥着显著的优势[2]。多种信号通路的参与及异常激活和肝纤维化的发生发展有着密切关系，其中包括Wnt/β连环蛋白(β-catenin)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路、转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β))/Smad通路、Hedgehog通路等。现本文将近年来中医药通过调控主要相关信号通路治疗肝纤维化的作用方式及机制研究展开综述。

1 中医药基于Wnt/β-catenin通路抗肝纤维化的机制

Wnt/β-catenin这一经典信号通路对于生物的发育不可或缺，也几乎涉及肝功能的各个方面，包括肝脏的发育、代谢到肝细胞的修复再生等，而在肝纤维化过程中HSC的激活与Wnt/β-catenin信号通路有关[3]。研究发现在肝纤维化过程中HSC处于激活状态时，β-catenin在肝脏发育信号下调或缺失时则会导致α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达及胶原沉积增加，而且Wnt信号的上调在被活化的HSC中表现得异常明显，但当Wnt受体拮抗分子Dickkopf-1 抑制了Wnt信号，即可将活化的HSC静止[4]。通过对Wnt/β-catenin下游靶基因的调节，还可以推动对成熟肝细胞的分化，当此信号通路在HSC活化过程中受到异常激活，HSC将分化物转化为肝肌纤维细胞，从而产生高水平的细胞外基质蛋白，促使肝纤维化的发生，因此肝纤维化的病理过程一般被认为与Wnt/β-catenin信号通路的参与紧密相关[5]。

1.1 抑制HSC激活

中药灵芝具有益心气宁心神的功效，在临床治疗中具有抗肿瘤、抗氧化、保肝等作用。白灵芝是灵芝中的一种，现代药理学研究表明灵芝及其提取物对不同因素造成的肝损伤均有保护作用，并能有效抑制肝纤维化，减轻脂肪肝形成[6]。肖毅力等[7]将大鼠HSC-T6用白灵芝提取物干预后进行细胞增殖测定，发现随着白灵芝提取物浓度的增加及干预时间的延长，HSC-T6细胞中的Wnt通路关键蛋白β-catenin、Frizzled-4表达量均下降，说明了白灵芝对肝纤维化的作用机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而使HSC由激活变为静止，进而起到其抗肝纤维化作用。

青蒿是一种能够改善患者肝纤维化程度，调节免疫功能的中药。张洪等[8]通过对大鼠HSC的培养，并运用中药青蒿的有效成分青蒿琥酯进行实验研究，结果显示，Wnt/通路的关键蛋白β-catenin、糖原合成酶激酶(glycogen syntase kinase,GSK)-3βser9表达随着青蒿琥酯浓度上升而下降，这是由于GSK-3βser9表达减少后，GSK-3β蛋白随之增加，有效降解了细胞中的β-catenin，进而起到抑制HSC激活的作用。

红景天具有扶正益气之用，其主要有效成分红景天苷具有保肝、抗炎、抗癌等作用，对不同阶段的肝损伤及肝病皆能起到治疗及改善作用[9]。杨斌等[10]通过进行体外实验，使用乙醛对HSC进行刺激，并观察红景天苷对其进行干预后的β-catenin蛋白及mRNA表达量，发现其水平与乙醛组相比呈现明显下降，故推测红景天可能是通过降低β-catenin的表达，令HSC中Wnt通路的信号传导下降，并抑制了HSC的活化。

1.2 调控下游靶基因表达

鳖甲为动物药，常用来治疗积聚、胁痛等病证，与肝纤维化所出现的临床症状相互对应。陈冠新等[11]通过细胞及动物实验的研究，发现鳖甲寡肽I-C-F-6能够有效降低肝纤维化大鼠的病变程度，抑制HSC及肝纤维化组织中β-catenin的表达，因此鳖甲治疗肝纤维化的机制可能与其对Wnt通路下游关键因子β-catenin的抑制作用有关。

益气活血利水汤是国家级名老中医陈崑山治疗肝硬化腹水的经验方，由黄芪、白术、茯苓、当归、赤芍、田七粉、丹参、柴胡、郁金、车前子、陈葫芦壳配伍而成。戴琦等[12]将肝纤维化大鼠用益气活血汤灌胃10周后采用实时荧光PCR法检测大鼠肝组织中Wnt 1及Wnt 3 a、Wnt 10 b、β-catenin mRNA 表达，结果显示表达均低于模型组，并且治疗组大鼠肝脏结构的病变程度较模型组有着明显改善，因而益气活血利水汤可能是通过对Wnt/β-catenin通路的基因表达进行调控进而达到治疗肝纤维化的效果。

鳖甲煎丸是中医经典方药，出自张仲景的《金匮要略》，临床上多用于治疗肝纤维化、肝硬化等，对减轻肝纤维化患者的症状有着确切的效果[13]。孙海涛等[14]通过实验发现鳖甲煎丸可一定程度的复原肝纤维化大鼠的肝功能，并通过肝组织的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性的提高来对肝细胞的脂质过氧化反应进行抑制，从而缓解了肝纤维化的程度。实验中使用免疫印迹检测法对病变大鼠肝组织中β-catenin、GSK、pGSK蛋白等进行检测，结果显示，上述蛋白表达明显下降，这表明鳖甲煎丸治疗大鼠肝纤维化的机制可能是阻断Wnt/β-catenin通路的信号和降低其下游关键靶基因的表达。

2 中医药基于PI3K/Akt通路抗肝纤维化的机制

PI3K是许多细胞作用过程中的关键调节因子，影响细胞存活、生长和分化，已有研究证实PI3K/Akt通路的激活能够缓解人体脂质过氧化，清除大量堆积的氧自由基，缓解细胞氧化损伤[15]。PI3K/Akt通路有几个重要节点，在该通路中起着至关重要的作用，导致肝脏细胞走向多种不同结果，其中由Akt介导的下游靶基因，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)被激活后，通过蛋白质合成机制的磷酸化刺激细胞的增殖，受到细胞生长因子的翻译调节，能够起到阻止细胞凋亡的作用[16]。众多研究结果表明，肝纤维化过程中肝细胞凋亡增加与PI3K/Akt信号通路被抑制有关[17]，并且该信号通路还参与 mTORC1的激活，可导致 TGF-β1表达异常增加，促使ECM沉积增加，还会导致成纤维细胞增殖和胶原蛋白的平行升高[18-19]。从而提示若想让肝纤维化的状态得到逆转，可从抑制PI3K/Akt通路信号的传导进行研究。

2.1 抑制过氧化物堆积

丹参味苦，微寒，主入心、肝经，具有化瘀消痈，凉血清心之效，常用于各种肝病，尤其是酒精性肝病的治疗，具有抗氧化损伤、清除自由基及抑制肝内坏死炎症反作用, 对肝脏具有保护作用[20]。吴灿等[21]通过实验研究发现丹参的提取物丹参多酚酸盐能显著降低大鼠的肝纤维化指标，病理模型组大鼠的肝组织中磷酸化的PI3K、Akt、mTOR表达可见上调，且丹参多酚酸盐对肝纤维化肝组织中磷酸化的PI3K、Akt、mTOR蛋白表达的下调效果与它的使用剂量呈正比，由此可知丹参对肝纤维化的治疗可能是通过此机制发挥作用。

鹿茸具有补阳益血、生精补髓健骨之功，已有研究表明，鹿茸能降低小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量，提高SOD、谷胱甘肽及谷胱甘肽过氧化物酶的活性，使肝损伤小鼠肝组织中肝脂质过氧化产物丙二醛的生成减少，起到保肝护肝的作用[22]。周霖等[23]用鹿茸提取物鹿茸多肽来治疗四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠，发现四氯化碳组PI3K及Akt蛋白表达量均明显升高，而鹿茸多肽治疗组则明显下降，表明鹿茸多肽可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路从而抑制肝纤维化的进程。

2.2 调控细胞凋亡

壮肝逐瘀煎由我国名老中医林沛湘据其临床治疗肝炎、肝硬化等疾病的经验所创，方中生黄芪、黄精、枸杞子等益气补精，健脾养肝，鳖甲、生牡蛎、虎杖等活血解毒，散瘀消积。已通过实验证实壮肝逐瘀煎能有效改善肝纤维化大鼠的肝脏微循环障碍[24]，并通过下调Fas、Fas L(肿瘤坏死因子配体，与细胞凋亡有关)，抑制HSC凋亡[25]。韦维[26]对肝纤维化大鼠的肝组织采用免疫组织化学法检测，其中肝纤维化组、复方中药治疗组中PI3K、Akt的表达较正常对照组均明显增强，而使用壮肝逐瘀煎对肝纤维化组大鼠进行治疗后，肝组织PI3K、Akt的表达较未经治疗的肝纤维化大鼠呈明显下降，由此推测壮肝逐瘀煎对肝纤维化的治疗作用与其抑制肝细胞PI3K/Akt信号通路传导有关。

白宁等[27]研究显示中药苦参的提取物苦参碱能够有效保肝、缓解肝纤维化，主要是通过对因肝脏缺血再灌注而引起的肝细胞凋亡进行调节。张弦[28]通过建立大鼠肝细胞凋亡模型，发现氧化苦参碱能通过降低PI3K/Akt信号通路下游p-Aktser473及p-GSK3β的表达，明显抑制大鼠肝细胞的凋亡，从而起到改善肝功能，缓解肝衰竭的作用，故可以认为PI3K/Akt通路能够通过调控细胞凋亡对肝纤维化进行有效治疗。

2.3 减少ECM沉积

芪参汤是临床上治疗肝纤维化的验方，由生黄芪、西洋参、丹参等益气健脾药和生山楂、荷叶、泽泻、女贞子、墨旱莲、绞股蓝、三七、生甘草等清热解毒、养肝益精药配伍组成。李硕熙等[29]通过实验研究发现与肝纤维化模型组大鼠相比，芪参汤治疗组大鼠肝纤维化程度得到明显改善，并能够使p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表达减少，结果表明芪参汤或能抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化，使窦周的胶原沉积得以清除和减少，进而起到抗肝纤维化的疗效。

鹅不食草作为广西的特色药材，在临床中对肝病的治疗中有着一定的效果。白法承[30]通过体外实验，用其提取物心菊内酯干预人的LX-2细胞及HSC-T6细胞，发现p-PI3K、p-Akt等关键蛋白的表达与未干预组相比在活化的HSC中显著下降，研究结果显示，鹅不食草能够通过抑制HSC的增殖和活化，使造成ECM过度沉积的胶原蛋白细胞因子分泌明显减少，提示该药改善肝纤维化的作用机制可能是通过下调PI3K/Akt通路信号传导，减少ECM沉积。

3 中医药基于TGF-β/Smad通路抗肝纤维化的机制

TGF-β作为主要的成纤维细胞因子，以三种同型存在，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β1与肝纤维化的发生最为密切。在肝损伤期间，坏死的肝细胞释放TGF-β1，激活相邻的HSC，进而造成胶原的沉积及肝纤维化的形成[31]。Smad蛋白是TGF-β1的关键细胞转录因子，在TGF-β/Smad通路调控肝纤维化的过程中，Smad3和Smad4表达的提高会起到促纤维化的作用。相反，Smad7的高表达能够负性介导Smad3诱导的纤维生成，阻断TGF-β/Smad通路信号的激活，并且阻止核因子-κB纤维化和炎症信号的传导[32]。TGF-β还能促使HSC的增殖及聚集，使HSC中纤连蛋白过度增生，并增加HSC基质侵袭促进纤维化相关的血管生成[33]，故调控TGF-β/Smad通路对肝纤维化的形成和治疗有着重要的意义。

3.1 抑制促纤维化因子表达

黄精是常用的补阴药，能够补益肝、脾、肾，王建忠等[34]认为黄精能够降低非酒精性脂肪肝大鼠的血糖含量，具有明显的护肝疗效，能一定程度的恢复肝功能。在王晓慧等[35]的实验中，黄精对肝纤维化大鼠能够起到治疗作用，并且经过治疗后的大鼠肝组织及血清中TGF-β1、细胞间黏附分子-1表达显著降低，故黄精治疗肝纤维化可能是通过下调TGF-β1而发挥作用。

荔枝核是荔枝的干燥种子，具有行气散滞、散寒除痛的功效，还能治疗疝气肿痛等疾病。黄红等[36]发现荔枝核的药理活性成分荔枝总黄酮能降低实验肝纤维化大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平, 具有保护肝功能, 减轻肝细胞损伤的作用，肝纤维化大鼠肝组织Smad3、Smad4 mRNA表达同对照组相比，有着明显增加，通过荔枝总黄酮进行干预治疗后，肝组织Smad3、Smad4、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1的表达不同程度的降低，因此荔枝总黄酮或是通过抑制Smad3、Smad4的高表达而对肝纤维化进行防治。

三七功效为活血祛瘀，通脉活络，具有止血不留瘀的特点。已有研究表明，三七治疗肾纤维化是通过抑制TGF-β1表达、减少ECM的沉积而起到其抗纤维化的作用[37]。王京凯等[38]通过观察三七总皂苷对肝纤维化小鼠肝组织的影响，发现皮下注射三七总皂苷能改善小鼠的一般状态、血脂紊乱和肝纤维化病理情况，同时能降低TGF-β1、Smad3的表达。因此，三七对肝纤维化的肝组织的治疗作用可能与抑制TGF-β/Smad信号通路，下调TGF-β1、Smad3水平有关。

3.2 抑制HSC的增殖

调肝理脾方中有黄芪、醋莪术、炙鳖甲、豆蔻等药物，能够疏肝理气、清热活血、健脾化湿，临床上主要用于治疗酒精性肝纤维化。王娇娇[39]通过酒精灌胃18周建立大鼠酒精性肝纤维化模型，进行药物灌胃治疗后发现调肝理脾方能够有效减少肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β1的含量，并且抑制TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表达，上调Smad7 mRNA的表达，从而减少HSC的增殖，改善肝纤维化的病理状态。

茵芍散由茵陈、赤芍、白芍、丹参、厚朴、黄芩、山栀子、白花蛇舌草等组成，具有活血去瘀，清热除湿的功效，于茵芍散中加入鳖甲、黄芪，为加味茵芍散，又增添补益扶正之功[40-41]。研究发现茵芍散能有效抑制HSC的增殖，对肝纤维化有一定抑制或逆转作用。而HSC在加味茵芍散血清干预下，TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表达均下降，并且TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表达效果与含药血清的浓度呈负相关。故茵芍散可能是通过抑制HSC的增殖及TGF-β1、Smad3的表达，从而影响TGF-β/Smad通路的信号传导。

4 其他信号通路抗肝纤维化的作用机制

由于参与肝纤维化病理进程的机制复杂、信号通路众多，故除了上述信号通路外，中医药还可能是通过调节丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、核因子E2相关因子、Hedgehog等信号通路治疗肝纤维化。如郑洋等[42]采用噻唑蓝(MTT)及免疫印迹的方法对实验细胞的增殖情况进行检测，使用莪术进行干预的实验组P38MAPK表达与未经干预组相比是明显下降的；临床经验方扶肝化纤汤具有益肝活血，化瘀解毒的功效，在实验研究中，用扶肝化纤汤进行灌胃的肝纤维化大鼠肝组织中P38磷酸化蛋白表达较未经治疗的大鼠显著下调，且病理和血清指标均明显下降[43]。白庆云[44]认为中药接骨草中的活性成分能够通过NRF2通路信号的上调，减少肝细胞的氧化应激及ECM的沉积，从而起到对肝纤维化的治疗效果。此外，还有研究认为藜芦中的活性成分白藜芦醇或能通过调节Hedgehog通路中的关键因子和下游靶基因，令HSC的增殖受到抑制，从而起到其抗肝纤维化的作用[45]。

5 小结与展望

本文以临床广泛运用的有效单味中药及复方中药为切入点，对参与肝纤维化发生发展的主要信号通路进行总结，进一步验证了中医药对肝纤维化治疗具有确切的疗效。肝脏细胞的异常激活因多种信号通路的参与而发生，中医药在调控信号通路抗肝纤维化的过程中主要的作用方式有：抑制HSC的活化或增殖，调节细胞凋亡，减少ECM的沉积及过氧化物堆积等。不同中药及复方作用于信号通路时对肝纤维化的调节互有交联重叠，如鳖甲一药，在调控Wnt/β-catenin通路抗肝纤维时主要以抑制其下游靶基因表达为主要作用方式，但同时又可通过抑制肝细胞氧化应激反应来减少肝损伤。此类中医药发挥多途径、多靶点、多成分作用抗肝纤维化背后的具体机制尚未完善，仍亟待更多实验研究进行补充和探讨，以为进一步阐明中医药与信号通路的关联及寻找肝纤维化治疗的新方向提供理论参考。