间充质干细胞来源外泌体修复炎症损伤的研究进展

刚乔健，何斯 综述，哈小琴 审校

1.兰州大学第二临床医学院，甘肃 兰州 730000；2.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院检验科，甘肃 兰州 730050；3.甘肃省干细胞与基因药物重点实验室，甘肃 兰州 730050

关键字：间充质干细胞；外泌体；炎症损伤；免疫

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种来源广泛，具有自我更新和多向分化能力的多能干细胞，拥有独特的免疫调节和迁移特性及炎症消退作用，可用于治疗炎症性疾病，且因其具有组织修复作用而具有治疗炎症损伤的能力。但由于MSCs治疗存在缺乏标准化产品、治疗窗狭窄、无法直接归巢至发病部位和难制定特异性治疗方案等问题，各种疾病的实际治疗效果不佳［1］。因此，MSCs 疗法的发展遇到了瓶颈，需要开发更好的治疗方式来解决其在临床治疗中的弊端并提升疗效。

MSCs主要以旁分泌的形式发挥治疗作用。MSCs来源外泌体（mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-Exos）作为MSCs 主要的旁分泌物质，可通过其包含的生物活性物质调节免疫细胞表型、功能和归巢，从而抑制发炎组织中的有害免疫应答，并促进受损实质细胞的存活和再生［2］。且相较于MSCs而言，MSC-Exos 具有更低的免疫原性和更高的反应性，可以规避MSCs在治疗疾病中的不足。因此，MSC-Exos可作为一种无细胞疗法逐步替代MSCs，用于治疗、缓解炎症反应并修复组织损伤。本文就MSC-Exos在炎症损伤中的应用进展作一综述，为MSC-Exos 的深入研究和广泛应用提供参考。

1 外泌体的生物学特性及功能

外泌体（exosomes）是一类直径30 ～150 mm的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），由晚期内体产生，通过出芽、内陷、多泡小体形成和多泡小体与细胞质膜融合的过程分泌至细胞外［3-4］。外泌体于1983年在绵羊网织红细胞中被首次发现［5］。最初外泌体被认为是一种细胞废弃物［6］，直至1996年，RAPOSO等［7］发现，来源于人和鼠的B淋巴细胞来源的外泌体可诱导抗原特异性主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅱ类限制性T 细胞免疫应答，外泌体的功能才逐渐受到人们关注。

外泌体可由多种细胞如肿瘤细胞、神经细胞、淋巴细胞和造血细胞等分泌，并可在多种体液如血液、浆膜腔积液、尿液、唾液羊水、乳汁和脑脊液中被检出［8］。外泌体包含多种生物活性物质，如蛋白质、脂质、DNA及RNA、微小RNA（microRNAs，miRNAs）、非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）等分子，膜转运相关蛋白以及包括Rab 蛋白、膜联蛋白、跨膜转运蛋白（CD9、CD63、CD81、CD82）、热休克蛋白（HSP70、HSP90）、整合素、MHC 蛋白等外泌体生物合成相关蛋白在内的融合蛋白［9］，是细胞间通讯的重要媒介。可参与各种生理和病理过程，包括抗炎、组织再生、血管生成和免疫［10］。此外，外泌体也被认为是一种合适的药物传递载体，有望用于疾病治疗［11-13］。

目前认为，外泌体主要由以下3 种方式发挥作用［14］：①外泌体直接识别靶细胞表面的信号分子，并与受体结合来传递细胞间信息；②外泌体通过与靶细胞融合释放其内容物发挥信息转运功能；③外泌体释放其内含物并作用于靶细胞表面受体，完成信息传递。

2 MSC-Exos对炎症损伤的调节机制

2.1 MSC-Exos对免疫细胞的调节

2.1.1 巨噬细胞 巨噬细胞是非特异性免疫系统中的关键组成部分，在维持组织稳态、免疫监视和炎性免疫中起重要作用［15］。巨噬细胞可分化为2 种表型：促进炎症反应的经典激活表型（M1 型）和抑制炎症反应的替代激活表型（M2 型）。MSC-Exos 通过调节巨噬细胞表型和活化来治疗炎症损伤。在小鼠肌腱-骨重建模型中，对损伤部位施用载有骨髓MSCExos的水凝胶，发现其能够将M1型巨噬细胞转化为M2型巨噬细胞，并由此促进抗炎因子白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和肿瘤坏死因子-β（tumor necrosis factor-β，TNF-β）的表达，以减少局部炎症反应并促进组织的再生及修复［16］。HUANG 等［17］研究的大鼠肩袖重建模型也证实了MSC-Exos 对巨噬细胞表型的调节作用。实验结果显示，尾静脉注射骨髓MSC-Exos 后，一氧化氮的释放和M1 型巨噬细胞表面标志物CD86 的表达降低，与此同时，肩袖重建后的大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平均有所降低，表明骨髓MSC-Exos 可抑制M1 型巨噬细胞的极化并干扰与M1型巨噬细胞相关的促炎因子分泌。此外，LIU 等［18］研究发现，MSC-Exos 可通过极化M2b巨噬细胞来减轻结肠黏膜的炎症。在生物性因子所导致的疾病中，MSC-Exos 也表现出抑制炎症的潜力。YAO 等［19］研究发现，在IL-1β 的促炎刺激下，MSC-Exos 可更有效地诱导巨噬细胞的M2 型极化并减轻败血症小鼠的症状，提高其生存率。PHINNEY等［20］研究发现，封装在人MSC-Exos中的miRNA可通过抑制Toll 样受体（Toll-like receptors，TLR）和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号传导（特别是MYD88 依赖性途径）以及炎症中心炎症介质的产生来抑制小鼠巨噬细胞的激活。在扩张性心肌病模型中，MSC-Exos 通过激活转录因子酪氨酸蛋白激酶2（januskinase 2，JAK2）及其下游信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）6 的表达，促进巨噬细胞向抗炎M2 表型极化［21］。此外，MSC-Exos 激活STAT3 通路的能力也已有研究证实［22］。NF-κB 与STAT3 之间的相互抑制串扰可调节巨噬细胞的M1／M2 平衡，其中NF-κB 通路的激活可诱导M1表型的极化，而STAT3通路的激活则有助于巨噬细胞向M2表型转化和抑制TLR4驱动的炎症反应［23］。但也有研究认为，MSC-Exos 通过抑制STAT3 发挥抗炎作用［24-26］。因此，需要进一步研究MSC-Exos对巨噬细胞表型和活化的影响。

MSC-Exos 也可通过其他方式调节巨噬细胞，进而调节炎症反应。LIU 等［27］研究发现，脂肪MSCExos 通过靶向介导miR-17 从亲代细胞向巨噬细胞的转移，可抑制核苷酸寡聚化结构域样受体家族PYRIN 域蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体的激活和caspase-1、IL-1β 和IL-6 分泌，从而治疗炎症性肝病。SHAO 等［28］研究发现，人脐带MSC-Exos 富含的miR-455-3p 可抑制巨噬细胞浸润并改善炎症性肝损伤。此外，SHEN 等［29］研究发现，趋化因子C-C-基元受体2蛋白高表达的MSC-Exos可降低CCL2 蛋白的浓度并抑制巨噬细胞的募集和其功能的激活。

2.1.2 树突状细胞（dendritic cell，DC） DC是功能最强的抗原呈递细胞，是非特异性免疫应答和特异性免疫应答的中央调节器。DC 具有捕获、处理和向CD4+幼稚T细胞呈递抗原的能力，活化后可表达MHC分子、共刺激分子（CD80、CD86、CD40）和促炎因子，并诱导T 细胞增殖［30］。已有研究证实，MSCs 可影响DC 的分化、成熟和功能，并导致DC 转化为抑制性或耐受性表型［31］。SHAHIR等［30］用MSC-Exos处理小鼠骨髓来源的DC，发现MSC-Exos 可降低DC 释放转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、IL-10 和IL-6 的能力，抑制DC 共刺激分子的表达或DC刺激淋巴细胞增殖的能力。另一项研究分离出小鼠脂肪MSC-Exos 并探讨其对DC 的影响，结果显示，使用MSC-Exos 处理小鼠的未成熟DC 后，DC 的共刺激分子（CD40、CD80、CD86）的表达明显降低，其对CD4+Th2 细胞的激活能力受到抑制，并因此减轻了由Th2细胞驱动的肺部炎症［32］。目前认为，MSC-Exos可间接下调DC 和T 细胞依赖性适应性免疫应答的免疫活性。然而关于DC 与MSC-Exos 之间相互作用的研究有限，需要进一步探讨以确定其机制。

2.1.3 T 细胞 T 细胞可在多个方面调节特异性免疫，如保护机体免受病原体侵害、针对肿瘤细胞的免疫监视和针对异体组织的免疫排斥反应，同时也是许多炎症和自身免疫性疾病的主要驱动因素［33］，在先天和后天免疫应答中均起到至关重要的作用。抑制T 细胞介导的免疫反应的有效方法是调节T 细胞的表型、增殖及活化。DU 等［34］将哮喘患者的外周血单个核细胞与MSC-Exos共培养，发现MSC-Exos可通过上调哮喘患者的外周血单个核细胞中抗炎因子IL-10和TGF-β1 的的表达来促进CD4+CD25+Foxp3+Treg的增殖，并以剂量依赖的方式增强其免疫抑制能力，这有助于缓解哮喘患者的免疫功能紊乱和气道炎症。LEE 等［35］报道，MSC-Exos 是MSCs 发挥T 细胞免疫抑制作用的机制之一，可通过上调p27kip1的方式诱导细胞周期阻滞并抑制T 细胞的活化。COSENZA等［36］研究了MSC-Exos 在关节炎中的免疫调节功能，发现MSC-Exos 以剂量依赖的方式降低了刀豆球蛋白A（concanavalin A，ConA）激活的脾细胞的增殖。在受此影响的淋巴细胞亚群中，CD8+IFNγ+T 细胞百分比下调，CD4+CD25+Foxp3+Treg 和CD4+IL10+Tr1细胞百分比上调。表明MSC-Exos 通过诱导Tr1 和Treg 诱导的增殖来间接发挥免疫抑制作用，证明了MSC-Exos抑制炎症的能力。其中，CD4+CD25+Foxp3+Treg 的分化可由MSC-Exos中的miR-1470上调P27-KIP1来介导［37］。ZHENG 等［38］研究发现，MSC-Exos可将miRNA-155-5p 转移至CD4+T 细胞中来调节其沉默调节蛋白1的表达，进而调节Th17与Treg的平衡。MSC-Exos 还可通过减少T 细胞亚群（CD4+IFNγ Th1细胞、CD4+Foxp3+Treg细胞和CD4+IL-17+Th17细胞）和其他炎症细胞在眼中的浸润来削弱实验性自身免疫性葡萄膜炎的炎症强度［39］。有研究者还指出，MSCExos 处理显著降低了Stat3 和p-Stat3 的表达以抑制Th17 细胞分化［25］。此外，也有研究者认为，T 细胞极化的改变是由M1／M2 巨噬细胞的平衡向M2 倾斜导致的［40］。值得注意的是，MSC-Exos 不能直接抑制CD8+T和CD4+T淋巴细胞的增殖［35-36，39］。

2.1.4 B 细胞 B 细胞也是特异性免疫中不可或缺的一部分，以分化成浆细胞和产生抗体为特征，除此之外，B 细胞拥有抗原呈递和产生细胞因子的能力。其中，浆细胞可产生IL-6，IFNγ 和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子来促进免疫反应，调节性B 细胞（regulatory B Cells，Bregs）则通过提供IL-10、IL-35 和TGFβ 来抑制免疫反应［41］。在发挥对T 细胞的免疫抑制功能的同时，COSENZA 等［36］还发现，MSC-Exos 可在抑制浆母细胞向浆细胞分化的同时，诱导Bregs 的生成。表现为CD138+浆母细胞的百分比降低，共培养上清中总IgG、TNF-α 和IL-6 水平下调，以及IL-10 浓度升高。KHARE 等［42］用骨髓MSC-Exos 培养B 细胞并观察其mRNA 变化，发现用骨髓MSC-Exos 培养后，有186个基因显著差异表达，表明骨髓MSC-Exos可通过抑制B 细胞上趋化因子受体的表达来抑制B细胞增殖并降低其趋化性。但也有研究表明，MSCs对骨髓中的B细胞有支持作用［43］。

2.2 MSC-Exos 对炎症细胞的调节 在结肠炎小鼠模型中，对小鼠进行MSC-Exos 注射治疗可显著降低经葡聚糖硫酸钠处理的小鼠中结肠髓过氧化物酶活性并减轻肠黏膜中嗜中性粒细胞浸润［18］。而嗜中性粒细胞的浸润在急性炎症反应的发生中起重要作用。由此推测，MSC-Exos 可通过影响嗜中性粒细胞的功能和活性来调节炎症反应。细胞自噬也是调控炎症反应的一项重要机制。在一项关于顺铂诱导的肾毒性研究中，人脐带MSC-Exos 可通过促进肾小管上皮细胞和肾组织自噬的方式，抑制顺铂引起的细胞凋亡和炎症反应［44］。此外，ZHANG 等［45］研究发现，MSC-Exos 可通过转染miR-126 降低高迁移率族蛋白B1 表达及抑制NF-κB／P65 活化来调节人视网膜内皮细胞，表明MSC-Exos 具有抑制高糖诱导的炎症反应的能力。

MSC-Exos 也是通过抑制神经炎症来改善神经系统功能的潜在选择。ZHAO 等［46］在急性软组织损伤试验中对小鼠进行MSC-Exos注射治疗的同时进行了体外模拟试验，发现MSC-Exos 通过逆转CysLT2RERK1／2 介导的小胶质细胞向促炎M1 表型极化和促进小胶质细胞向抗炎M2表型极化，减轻脑损伤并抑制小胶质细胞炎症。ZHAO 等［47］发现，CysLT2R 可被MSC-Exos 中的miR-223-3p 以剂量依赖性的方式抑制。有研究发现，MSC-Exos 通过NRF2-NF-κB 信号通路调节星形胶质细胞活化。由于星形胶质细胞在调节和限制中枢神经系统炎症方面起关键作用，且星型胶质细胞增生时间较小胶质细胞更长，造成的炎症损害更大［48-49］。

3 炎症疾病的治疗及其治疗方式

基于MSCs 和MSC-Exos 治疗炎症损伤的多种机制，MSCs 和MSC-Exos 可用于多种炎症疾病的研究和治疗。主要包括关节炎、炎症性肠病、移植物抗宿主病、多发性硬化症、糖尿病和系统性红斑狼疮，并扩展至包COVID-19在内的炎症性肝脏和肺部疾病［50］。

目前已开发出了包括直接注射、静脉注射、腹膜内注射、口服给药和水凝胶包裹在内的多种方法将MSC-Exos 用于治疗，其中水凝胶包裹疗法由于其高效性和良好的生物相容性而备受关注［51］。在一项实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的研究中，发现鼻腔给药可有效缓解EAE 的症状，并且作为一种新型非侵入性治疗方法，鼻腔给药与常规方法（静脉注射和腹膜内注射）的治疗效果相同［52］。此外，HARREL等［53］开发了一种来源于MSC-Exos 的生物工程产品外泌体衍生的多个同种异体蛋白旁分泌信号因子（exosomederived multiple allogeneic protein paracrine signaling，Exo-d-MAPPS），可显著下调促炎因子（TNF-α、IL-12、IFNγ、IL-1β）的水平，提高小鼠血清样本中抗炎因子IL-10 浓度；降低巨噬细胞、中性粒细胞以及自然杀伤细胞、自然杀伤T 细胞产生炎性因子的能力，抑制巨噬细胞和DC 的抗原呈递特性并促进免疫耐受性DC、M2 型巨噬细胞和Treg 的产生，从而减轻慢性气道炎症。更重要的是，30 例慢性阻塞性肺疾病患者在接受Exo-d-MAPPS 治疗后均未产生不良反应。此外，脂多糖、缺氧、IFNγ 和甘油酸等预处理也可提高MSC-Exos 的治疗效果［25-26，54-55］。因此，开发出适合的MSC-Exos疗法将是MSC-Exos给药治疗的研究重点。

4 总结与展望

MSCs 由于其在免疫调节、组织修复、刺激血管生成和抗炎等方面的作用为多种疾病的治疗提供了新的希望。但其具有较高的生产成本、免疫排斥反应以及肿瘤和异位组织生成等方面的潜在风险，临床应用受到限制并逐渐被其旁分泌物质MSC-Exos取代［51］。尽管MSC-Exos 在疾病治疗方面已有一定进展，但关于其在炎症方面的临床应用和机制研究仍比较缺乏，需要从细胞分子、免疫细胞、蛋白组学、基因和信号通路等方面进行深入的探讨，阐明MSCExos的抗炎机制和作用。此外，对比不同细胞来源、不同给药途径和剂量在治疗效果上的差异，开发新的预处理细胞的策略和研发新的外泌体疗法也将是未来研究的重点。