逍遥散类方治疗肝癌的研究进展

李卓娴 徐丽静 夏猛

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率居全球恶性肿瘤第三位,具有起病隐匿、发病率高、致死率高、术后复发率高、预后差、生存率低的特点。世界卫生组织估计到2030年全球将有超过100万的人死于肝癌。目前治疗肝癌的方法主要有移植、切除、射频消融、靶向药治疗等,但肝癌患者仍面临着高死亡率、高复发率、耐药性及严重副作用等问题。因此,寻求低毒、耐药性小的肝癌治疗策略仍是当前亟待解决的关键问题。肝癌属于中医学“癥瘕”“鼓胀”等范畴,从临床证型看,肝郁脾虚型是其重要的一类证型。逍遥散出自《太平惠民和剂局方》,以疏肝解郁、健脾养血作用见长。目前用于治疗肝癌的常见逍遥散类处方有黑逍遥散、加味逍遥散、四逆散、加味四逆散、肝积方、丹栀逍遥丸、柴胡疏肝散、逍遥丸等,这些处方对肝癌的细胞增殖、免疫功能、神经系统、肝功能以及肠道菌群调节等方面均具有干预作用。本文通过检索相关的研究文献,对以上功能和作用进行了搜集和整理,总结如下。

1 逍遥散类方对肝癌肿瘤细胞的影响

1.1 阻滞细胞周期抑制肝癌细胞增殖

细胞凋亡是由细胞内基因及其产物调控发生的一种程序性细胞死亡,阻滞细胞的周期进程可抑制细胞的增殖及诱导凋亡,对肝癌治疗具有着重要意义。逍遥散主要成分姜黄素作用于肝癌细胞SMMC7721、Huh-7,诱导其S期细胞增加以及G0-G1期细胞减少,阻滞肝癌细胞的正常周期,显著减少细胞增殖[1-3]。不同剂量的四逆散含药血清处理肝癌HepG2细胞后发现[4],随着剂量的浓度增加,G1期细胞随之增加,G2期随之减少,使肝癌细胞滞留于G1期,阻滞其细胞周期,抑制肝癌细胞的增殖,其中方中所含的山奈酚活性成分发挥着显著作用[5]。山奈酚是多种疏肝药物的重要成分之一,如白芍、栀子、甘草、柴胡、丹皮等疏肝重要中均含有该成分,而这几种药物也多包含在逍遥散类方中,说明逍遥散类方治疗肝癌的重要机制之一可能与方中疏肝类药物的活性成分山奈酚有关。

1.2 调控Ca2+信号诱导肝癌细胞凋亡

细胞间的信号传导可作为肿瘤发生关键环节之一[6],Ca2+作为参与调节多种神经细胞功能活动的信使,Ca2+失衡会引起神经元损害并成为“最后共同通路”导致细胞死亡[7]。加味逍遥散对离体的肝癌SMMC-7721细胞的增殖具有较强抑制作用,且具有明显的浓度依赖性[8],其由调控Ca2+凋亡信号从而调节与其相关敏感的关键酶诱导凋亡,以此抑制肝癌细胞增殖并诱导凋亡。另有研究表明,黑逍遥散及逍遥散中也存在着调控Ca2+信号的功能[9-10]。目前对于此方面的研究在逍遥散类方中还较少,但从已有研究表现出的效果看,逍遥散类方对其作用确切,但具体是什么成分对其发挥作用、其机制如何尚有待深入探讨。

1.3 调控癌基因、抑癌基因诱导肝癌细胞凋亡

Bcl-2癌基因家族具备抑制细胞凋亡的作用,Bcl-2与Bax的聚合抑制Bcl-2的活性从而促进了细胞的凋亡。四逆散可使Bcl-2表达下降,Bax、Caspase-3、Caspase-9及Cyt-c表达升高,诱导肝癌细胞凋亡、抑制其增殖[4];肝积方也可通过调节Bcl-2癌基因家族并激活Caspase-3,诱导线粒体途径发挥促细胞凋亡作用,最终抑制肝癌细胞的增殖并发挥抑瘤作用[11-15]。TP53为与人类半数肿瘤相关的基因,其所表达的P53蛋白可抑制肿瘤细胞的生长,促进肿瘤细胞的凋亡。四逆散中所含的槲皮素诱导TP53抑癌基因导致G2/M细胞周期阻滞,从而推动了细胞凋亡进程[5];运用其干预移植性肝癌裸鼠可使肝癌裸鼠肿瘤组织中Sirt1蛋白表达减少,p53乙酰化程度增加,经SIRT1/p53信号通路途径[16-18],促进人肝癌HepG2细胞凋亡。逍遥散类方对于肝癌细胞凋亡的诱导和作用机制研究目前较为普遍,也基本成为评价逍遥散类方是否具有抗癌作用的有效评价指标之一。

1.4 调控血管生成因子,抗肿瘤血管生成,抑制肝癌细胞侵袭

肿瘤细胞的血管是肿瘤细胞获得血氧、营养的重要通道,抗肿瘤血管生成可通过抑制血管的生存和数量,抑制肿瘤细胞的生长、转移从而发挥抗癌作用[19-20]。使用加味四逆散干预治疗H22腹水瘤小鼠与S180实体瘤小鼠,实验结束后检验其血清中血管内皮生长因子的浓度水平并观察经苏木精—伊红染色的肿瘤病理组织切片发现,加味逍遥散可降低模型小鼠血清血管内皮长生因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)浓度,减少肝癌组织内微血管的密度、数量,抑制肿瘤组织血管生成[21];逍遥散也可下调VEGF表达,抑制血管的生成并干预原发性肝癌[22]。肝积方作用于肝癌的差异基因包含与血管生长因子相关的早期生长反应基因-1,抑制肿瘤血管生成为肝积方作用于肝癌的重要机制之一[23]。

在抑制肝癌进展的过程中,抑制肝癌细胞的增殖、分化、侵袭以及促进凋亡发挥着重要作用,是抗肝癌的重要机制之一。聚焦于对肝癌肿瘤细胞的影响,对探究逍遥散类治疗肝癌的具体作用机制具有重要意义。根据上述文献得知,目前对逍遥散类方影响肝癌细胞的机制研究多汇聚在通过阻滞细胞周期,调控Ca2+信号、癌基因Bcl-2、抑癌基因TP53、血管内皮长生因子等方面发挥抑制肝癌细胞增殖、侵袭,促进其凋亡的作用,缺乏对其他影响肝癌细胞机制的研究,如肝癌细胞自噬[24]、黏附[25]、铁死亡[26]、焦亡[27]等。逍遥散类方通过影响肝癌细胞治疗肝癌层面的研究仍有许多未涉及的区域,有待各学者进一步的探索、发掘以及验证。

2 逍遥散类方对免疫机制的调节作用

2.1 调控炎性细胞因子

细胞因子是一类具有调控细胞免疫激活、生长、分化作用的小分子或蛋白质物质,其中参与炎性反应的称炎性细胞因子,包含白细胞介素(interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等,可调节肿瘤微环境,参与肿瘤过程。使用四逆散加味治疗肝郁肝癌模型大鼠,实验结束后制备脾细胞悬液测定IL-2、γ-干扰素的活性,四逆散加味治疗可增强肝癌大鼠脾淋巴细胞产生IL-2、γ-干扰素的能力,提升机体免疫功能[28];可提升肝癌荷瘤小鼠的TNF-α、IL-12、IL-6含量水平,提升脾脏指数,提高肝癌裸鼠模型的免疫力,发挥抗肿瘤免疫力的调控功能[16]。加味四逆散也同样具备着调节免疫机制的作用,由提高肝癌荷瘤小鼠的IL-2活性而发挥作用[21]。此方面研究说明,在发挥抗肿瘤过程中,逍遥散类方对调节炎症状态具有作用,这可能也是中医药在临床发挥抗肿瘤,改善患者生存质量的机制之一。

2.2 调节淋巴细胞亚群

淋巴细胞作为机体重要的免疫细胞,可分为T、B、NK细胞三大类,而淋巴亚群作为机体免疫功能及状态平衡反映的重要指标,参与免疫过程,反映免疫状态。加味四逆散可通过提高NK细胞增殖活性、T淋巴细胞活性,发挥调节免疫机制的作用[21]。四逆散提高肝癌大鼠的脾T、B淋巴细胞增殖能力,提高肝癌大鼠的免疫功能[28]。由肝积方进一步加工制成的疏肝清热消积颗粒可通过调节CD4+、CD8+,增加肝癌荷瘤小鼠的T淋巴细胞增殖并刺激总T淋巴细胞的生长,发挥改善免疫的作用[29]。

在机体出现肿瘤时,免疫系统可迅速识别、清除微环境中的肿瘤细胞,免疫功能在抑制肿瘤的发生、发展中发挥着重要的作用。大量临床研究发现,放、化疗或其他介入疗法的治疗在杀灭肿瘤细胞的同时会损伤机体的免疫功能,逍遥散类方治疗肝癌可有效增强肝癌患者的免疫功能,对增强机体抗肿瘤免疫能力及杀灭肿瘤细胞具有重要意义。但现阶段对逍遥散类方发挥免疫机制调节治疗肝癌的研究多集中于临床研究,基础研究鲜见,且多于进行其他作用机制研究时发现,对于逍遥散类方通过调节免疫机制发挥肝癌治疗作用的相关研究较少,且多汇集于调控炎性细胞因子、淋巴细胞亚群方面,深入研究逍遥散类方通过调节免疫机制发挥肝癌治疗作用的具体机制,为临床运用提供新思路,以期提高肝癌患者的生存质量。

3 逍遥散类方对神经系统的调节作用

3.1 对单胺类神经递质的调节作用

单胺类神经递质为中枢神经递质中的一种,其重要组成包括5-羟色胺及多巴胺等,当其神经元功能下降时会导致快感缺乏出现绝望、焦虑行为,与抑郁等精神疾病密切相关[30]。加味逍遥散提高肝癌大鼠脑内多巴胺、5-羟色胺等单胺类神经递质水平,发挥调节神经系统的作用[31]。柴胡疏肝散、四逆散同样具备着调节神经系统的作用,可下调抑郁小鼠模型大脑、肝脏、结肠中犬尿氨酸/色氨酸比值及上调肝脏中5-羟色胺/色氨酸比值,由调控色氨酸的代谢进而调节神经递质发挥其抗抑郁作用[32]。临床上,肝癌患者多伴有严重的情绪障碍,出现抑郁、焦虑等,逍遥散类方在调节患者情绪方面,具有疏肝解郁、调畅情志的作用,从其作用机制看,逍遥散类方对兴奋性神经递质的上调作用,可能正是其既能抗癌,又能改善患者情绪的重要原因之一。

3.2 调节神经营养因子

脑源性神经营养因子 (brain-derived neurotrophic factor,BDNF)具有修复、再生神经的功能。慢性应激及促抑郁的造模手段会导致海马BDNF的减少、神经元凋亡的增加以及再生能力的受损。神经营养因子3则为最有效的神经支持因子之一,可促进神经元的发育、存活以及修复。逍遥散不但可降低由慢性应激所诱发的肝癌标志物甲胎蛋白水平的上升,预防由慢性应激所诱发的肝癌的早期发生[33-34],还具有保护神经系统、规避应激的作用,可恢复由慢性束缚应激所导致的神经营养因子BDNF的减少,并增加神经因子3表达,从而发挥保护神经系统的作用[35];还可增强抑郁小鼠海马中神经营养因子BDNF的表达水平,恢复抑郁小鼠海马中的神经损伤[36]。

在肝癌的治疗过程中,中医药可发挥整体调节的作用。抑郁作为肝癌的一个重要并发症,中医药可干预抑郁、焦虑等情绪问题,在临床治疗肝癌中运用疏肝解郁之法,对改善肝癌患者情绪、提高生活治疗、延长生存期具有重要意义。除调节单胺类神经递质、神经营养因子外,中医药还具有通过调节下丘脑—垂体—肾上腺轴、血管内皮生长因子以及相关的信号通路等调节神经系统并辅助治疗肝癌的作用机制[37],但目前对逍遥散类方通过上述机制发挥神经系统调节并辅助治疗肝癌的研究尚未见报道,仍有待进一步研究。

4 逍遥散类方可以抗氧化应激及控制炎症反应,保护肝功能

4.1 调节相关抗氧化酶

超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶均属于抗氧化酶,可以降低机体氧化速度,降低氧化损伤对机体造成的伤害。机体清除氧自由基的能力常由超氧化物歧化酶活力间接反映,机体受自由基损伤程度则常由丙二醛含量间接反映。谷丙转氨酶与谷草转氨酶的显著上升证明了肝脏的受损,通过减低二者的水平可发挥护肝作用。逍遥散可降低血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性并增加超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平,同时降低丙二醛的含量,经抗氧化应激而发挥护肝作用,其减轻氧化应激的损伤并发挥保肝作用[38-39],对肝功能具有一定的保护及修复作用[40],并具有一定浓度依赖性[41]。四逆散及加味四逆散也具备肝脏保护的作用[42-43],同样由下调应激大鼠血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶表达水平来改善肝损伤[44-45]。逍遥散类方在肝癌的治疗中往往表现出对肝脏的保护作用,其具体作用机制与调节抗氧化酶,抗氧化应激密切相关。

4.2 激活核因子E2相关因子2信号通路

核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2 related factor2,Nrf2)是胞外生物与氧化应激的主要协调者之一,可通过抗氧化响应元件(antioxidant response element,ARE)的结合来调节相关抗氧化、抑炎基因进而发挥调控氧化应激的作用[46]。逍遥散可激活Nrf2-ARE信号通路来发挥其抗氧化应激的作用[47],其对氧化应激的对抗作用还可通过激活Nrf2的上游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路并激活Nrf2-Keap1信号来改善氧化应激状态[48]。Nrf2信号通路是抗氧化应激的重要通路之一,但目前逍遥散类方对于Nrf2信号通路的研究较少,仍有待挖掘。

4.3 抑制一氧化氮水平

一氧化氮(nitric oxide,NO)参与宿主的防御及免疫并调节炎症反应,宿主在对病毒、细菌感染的反应中,NO会过量表达并通过促氧化应激促进某些发病机制,阻滞NO释放从而抗氧化应激是阻滞炎症损伤细胞、诱发肝损伤的重要方法之一。丹栀逍遥丸基于其方中组成中药的药物特性而具备抗氧化活性及NO抑制相关的抗炎特性[49]。四逆散可显著降低应激负荷肝损伤小鼠肝组织中的NO水平[50]。

肝癌的治疗除抑制肿瘤细胞的生长外,还可以通过保护自身肝脏功能发挥治疗作用。中医药参与肝癌治疗,可发挥缓解术后症状、保护肝功能、降低术后不良反应的发生率等多种作用。逍遥散类方可通过调节抗氧化酶、激活Nrf2信号通路以及抑制NO水平发挥抗氧化应激及控制炎症反应从而保护肝功能的作用。

5 调节益生菌的丰度,恢复肠道菌群的构成

逍遥散可以增加肠道中梭菌纲、Faecalibaculum属丰度,降低Muribaculaceae科的丰度,使有益菌丰度增加、致病菌丰度减少[51];还可以升高拟杆菌科Bacteroidaceae的丰度,恢复肠道微生物的多样性,发挥调节肠道菌群的作用[52-53]。逍遥丸的主要成分芍药苷可增加益生菌的丰度并调节肠道菌群的组成[54]。逍遥散及其拆方可保护菌群的构成及多样性,部分恢复肠道菌群的正常结构,当健脾药物被去掉时逍遥散对肝脏的保护作用会被减弱[55]。

最近几年的研究表明,肠道在肝癌的治疗过程中表现出良好的作用,人体肠道中正常菌群可形成保护屏障抵御病原体,而肠道菌群的失调会导致多途径的推动肝癌的发生与发展,通过改善肠道菌群可起到改变甚至逆转肝癌进展的作用。逍遥散类方可以通过调节益生菌的丰度来恢复肠道菌群的构成,但其如何通过调控肠道菌群来发挥肝癌治疗的具体作用机制尚未见报道,仍待深入研究。

6 结语

逍遥散类方是一类以调和肝脾、疏肝解郁为主旨,在逍遥散基础上随证化裁衍化出来的方剂。逍遥散类方兼具备能疏肝解郁、健脾养血的特点,可广泛应用于肝癌的现代临床治疗中。此类方药在肝癌的临床治疗中,不但表现出抑制肝癌细胞的增殖与侵袭、促进肝癌细胞凋亡、修复患者免疫功能,对神经、肝功能的保护作用,而且还表现出对肠道菌群的调节作用。这充分的说明了逍遥散类方在抗癌过程中具有多靶点、多环节、多层次的综合抗癌作用。但从目前的研究看,大部分的研究只从抑制肿瘤生长、侵袭、免疫等方面的某个环节入手,未能真正从网络整体效应机制入手,并不能真实诠释或揭示逍遥散类方的整体机制,也没有真正体现其中医功能特点。从以上文献结合逍遥散类方本身的功能特点看,其疏肝解郁作用很可能与对神经功能的保护作用有关,如逍遥散、加味逍遥散均显示出对BDNF和5-羟色胺水平的提升作用,正恰合了其对情志病证的调节作用。其健脾养血作用,则可能与对肠道菌群的调节作用以及对肿瘤血管的抑制作用(抑制肿瘤血管而达到促进全身血液运行的作用)有关,如逍遥散、肝积方等对VEGF及早期生长反应基因-1具有重要的调节作用。其抗癌作用则大多是通过抑制肝癌细胞生长、调节免疫功能实现。这些数据表明,在肝癌的治疗过程中,逍遥散类方虽然具有一定的抗癌作用,但其主要的功能更多是对全身整体功能的调控而实现,在临床及实验研究中还需要通过整体网络作用来全面阐释其抗癌靶点和效应机制。