细胞骨架中微丝观察实验的优化探索

王敏君，刘清桂，陈 费

(海军军医大学基础医学院细胞生物学教研室， 上海 200433； △通讯作者)

医学细胞生物学是通过研究细胞结构、功能和生命活动，将细胞生物学的理论知识和研究技术引入各种医学问题探讨一门学科，是医学、生物学课程中重要的基础课程[1]。其实验课程与理论课程相辅相成，实验课程的主要目的不仅是辅助学生对理论知识的深入理解，更是希望能够培养学生分析、解决问题的能力、科研创新能力以及对科学研究的兴趣和热情，在医学细胞生物学的整个教学环节起着举足轻重的作用[2,3]。细胞骨架是真核细胞中的蛋白纤维网络系统，与细胞的形态功能、生命活动密切相关，是医学细胞生物学理论课程的重点内容。通过对细胞骨架的观察，学生能够加深对细胞骨架理论概念的理解，也有助于认识细胞生命活动的现象。

微丝是普遍存在于真核细胞中由肌动蛋白组成的骨架纤维，可成束、网状或散在分布于细胞质中，对构成细胞支架和维持细胞形态的功能有着重要的作用。由微丝形成的微丝束又称为应力纤维，是一种较稳定的结构，多与细胞的长轴平行，贯穿细胞的全长。微丝伴随着细胞形态的变化和生命活动不断地发生组装和去组装的过程，而此过程中常受到一些药物的影响从而影响细胞功能的正常执行，进而导致相关疾病的发生。细胞松弛素B(Cytochalasin B)主要破坏微丝的组装，并破坏细胞的形态结构以及细胞移动、分裂等生命活动。而去除细胞松弛素B后，微丝的结构和功能又可恢复。

细胞内微丝束的观察是生物医学本科层次开设的实验必修项目之一。现有的医学细胞生物学实验教程只关注于微丝染色的实验本身，并未将其与实验教学的理论目的结合，教学效果不明显。而传统的实验教学多选用单一的考马斯亮蓝染色标记微丝束，该染色方法为非特异蛋白染色，不能特异性区别细胞骨架组成。为此，近年来随着荧光显微镜在本科教学实验室的普及，我们从微丝功能角度、药物作用对细胞影响原理等角度出发对该实验课程进行了以下改进和优化，取得了较为满意的实验效果。

1 实验课程设计内容优化

1.1 课程设计目标要求

我们以理解微丝功能-构成细胞的支架并维持细胞的形态为课程目标。学生体外培养细胞用细胞松弛素B处理不同时间后再逐步恢复，结合不同染色方法观察各个状态下细胞内微丝分布掌握微丝作为细胞骨架成分的重要功能。

1.2 课程设计内容

成纤维细胞是微丝束观察较好的细胞材料，细胞内微丝是由肌动蛋白组成，通过肌动蛋白的显色而观察细胞内微丝的分布。考马斯亮蓝染色原理是其能够与蛋白质结合，检测出细胞内的蛋白质，光学显微镜下即可观察到细胞内蛋白质的分布情况，是检测细胞内微丝束较为常用的方法。而鬼笔环肽只与聚合的微丝有强亲和作用，而不与肌动蛋白单体分子结合，更加明确了细胞内微丝束的分布状态。我们在教学实验过程中采用特异性荧光染料Alexa Fluor®88鬼笔环肽来直接标记染色，并在荧光显微镜下观察微丝束。两种染色方法结合光学和荧光显微镜观察可帮助学生更好地分辨细胞内微丝分布。

为更加突显微丝在细胞支撑骨架和形态维持中的重要作用，体外培养细胞分别进行不同时间的细胞松弛素B处理以及撤去细胞松弛素B后再培养，以观察各组成纤维细胞的形态和微丝束的分布，分析比较微丝在细胞中的形态特征以及其与细胞形态结构的相关性。

2 实验课程实施方案优化

2.1 实验材料准备

两位学生为一组。实验教师为每一组准备3个6孔板的细胞。第一板6孔板接种6孔成纤维细胞，实验教师待细胞生长密度为60%后进行处理。其中两个孔为不做任何处理的成纤维细胞，两个孔为细胞松弛素B处理半小时的成纤维细胞(即在细胞培养液中加入终浓度为10 μM细胞松弛素B)，两个孔为细胞松弛素B处理半小时后PBS清洗3遍添加新培养基继续培养2 h的成纤维细胞。第二板6孔板接种3孔成纤维细胞，实验人员待细胞生长密度达60%后，更换带有细胞松弛素B的培养基。其中第一孔为原培养基，第2和3孔为含有细胞松弛素B的培养基，第2孔培养10 min，第3孔培养30 min。第三板6孔板接种4孔成纤维细胞，实验教师待细胞生长密度达60%后，全部更换带有细胞松弛素B的培养基培养30 min。随后，实验教师再更换为无细胞松弛素B的新鲜培养基继续培养0，0.5，1和2 h。所有处理组细胞由实验教师计算好时间并在学生实验开始前准备好，到处理时间后将细胞板从培养箱取出，封闭容器以最大限度降低细胞生命活动。除第一个6孔板外，对于其余两个6孔板，实验教师处理好后细胞弃培养基，PBS洗涤3次，滴加1%多聚甲醛预固定。

为节约上课时间，实验用所有试剂由实验教师提前准备好。主要试剂为：PBS缓冲液、1%TritonX-100、M-缓冲液、3%戊二醛溶液、4%多聚甲醛、0.2%考马斯亮蓝R250染液、2 μg/ml Alexa Fluor®488鬼笔环肽、2 μg/ml DAPI。细胞松弛素B粉末溶解于DMSO试剂，储存浓度为10 mM。

2.2 实验实施过程

2.2.1 细胞通透及固定 第一个6孔板由一位学生进行。学生弃掉6孔板内培养基，更换PBS洗涤3次；其中3个孔加入1%TritonX-100液，置于37 ℃恒温箱中处理15-20 min，以去掉细胞骨架以外的部分蛋白质。立即用M-缓冲液轻轻洗涤3次，每次3 min，使细胞骨架稳定；然后再加入3%戊二醛溶液继续固定10 min，固定后PBS清洗3次，后续采用考马斯亮蓝染色；另3个孔细胞滴加4%多聚甲醛固定5 min，PBS清洗3遍，后续采用荧光染色。学生应合理安排实验时间，可等待TritonX-100处理结束后再进行另三组成纤维细胞的多聚甲醛固定。

另两个6孔板由第二位学生进行。学生在固定之前先在倒置显微镜下进行拍照，记录不同处理组细胞的形态；随后，弃孔板中原有1%多聚甲醛溶液，滴加1 ml 4%多聚甲醛固定5 min，PBS清洗3遍，再进行荧光染色。

2.2.2 染色与观察 考马斯亮蓝染色组中，学生加入0.2%考马斯亮蓝R250染液染色30 min，然后自然水清洗数次，再滴加少量PBS后置于普通倒置显微镜下观察。荧光染色组中，学生加入2 μg/ml Alexa Fluor®488鬼笔环肽，室温染色30-60 min，PBS清洗3次后，滴加2 μg/ml DAPI染液，然后置于荧光倒置显微镜下观察。

3 实验结果分析

3.1 实验结果显示

普通光学显微镜下，学生观察到无细胞松弛素B处理和细胞松弛素B处理30 min后再撤去继续培养2 h的小鼠成纤维细胞内蓝色的微丝贯穿细胞轴，细胞核染色为深蓝色。而细胞松弛素B处理组细胞内除深蓝色细胞核外，无明显的浅蓝色丝状结构。鬼笔环肽荧光染料染色后，荧光显微镜观察到对照组和恢复组的小鼠成纤维细胞内明显的绿色微丝束结构，粗而密集的微丝组成的应力纤维成束分布在细胞质中，而细胞松弛素处理组细胞内未见明显的绿色荧光束。这两种染色方法都清晰地观察到细胞内微丝束的分布。

其次，倒置显微镜下观察到未进行细胞松弛素处理的成纤维细胞铺展好，细胞形态舒展，细胞胞体较大呈多边形，细胞有突起。而随着细胞松弛素B处理时间的延长(分别处理0，10，30 min)，细胞铺展逐渐缩小，突起变少。鬼笔环肽荧光染色下，学生也同样观察到细胞松弛素B处理10 min后，伴随着细胞边圆，细胞内微丝束明显收缩变短。在细胞松弛素处理30 min后，细胞内微丝束消失，细胞进一步变圆，细胞间间隙扩大，细胞突起减少。结果说明细胞松弛素B可有效抑制微丝的组装聚集，而微丝的去组装则极大地影响了细胞形态维持。

而培养的成纤维细胞去除细胞松弛素B后，结果显示，伴随着正常培养基下成纤维细胞培养时间的延长(分别恢复0.5，1和2 h)，细胞形态逐渐恢复，细胞重新铺展，突起变多。同样，撤去细胞松弛素B 2 h后，鬼笔环肽荧光染色显示细胞内微丝束呈平行排列，沿着细胞轴分布。

3.2 微丝束分布现象分析

考马斯亮蓝和鬼笔环肽荧光染料都可以清晰地观察到细胞内微丝束的分布，但是鬼笔环肽荧光染色实验过程相对简单，培养板底部贴壁细胞也不会因Triton X-100的作用而脱落，增加了实验的成功率和可操作性。细胞松弛素B可有效地抑制细胞内微丝的组装聚集，在细胞松弛素B处理的细胞中，由于微丝逐渐被破坏而不能够支撑细胞以及维持细胞形态，使得细胞失去突起、不能铺展而形状变圆。而去除细胞松弛素B后，肌动蛋白重新聚合形成微丝，细胞内微丝组成的应力纤维结构逐渐恢复，从而导致细胞形态再次恢复正常，微丝应力纤维也沿着细胞轴分布。

4 课程优化的教学效果

微丝功能-构成细胞的支架并维持细胞的形态实验课程设计的结果：100%的学生充分理解了微丝作为细胞结构支架的功能体现，理解实验原理，掌握了染色技术；90%以上的学生实验结果良好，两种染色方法都观察到微丝的分布与定位。传统的考马斯亮蓝染色原理是针对蛋白质的染色，并不能特异地显示微丝的分布，而且Triton X-100处理也有可能不是完全将非细胞骨架蛋白破坏掉，会影响实验结果显示。我们增加直接荧光鬼笔环肽染色能够特异性地显示微丝在细胞内的分布，有助于学生对微丝结构的理解和掌握。其次，我们通过设计细胞松弛素B药物处理的不同时间以及去细胞松弛素B药物继续培养不同时间，结合倒置显微镜观察细胞形态和荧光纤维化下对微丝的分布，更好地帮助学生理解微丝在细胞形态维持中的重要作用。

细胞骨架的观察是医学细胞生物学实验课程中一个经典且重要的实验。实验课程的优化，不仅加深学生对细胞骨架中微丝的认识，也提高了学生的学习兴趣以及其对科研探索的积极性[4]。