NLRP3炎性小体及其在急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征中的研究进展*

高志丹，金 娟，黄翠萍

(1.湖北科技学院医学部药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院医学部健康医学院)

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是由各种肺内、外致病因素(如肺炎、败血症、休克、呼吸道细菌或病毒感染)导致的急性、弥漫性、炎症性肺损伤，进而引起严重的急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[1]。由于缺少特效药和发病机制复杂，ALI/ARDS的发病率和死亡率在全世界都很高[2]。特别是新型冠状病毒肺炎(COVID-19)正在全球肆虐，重者也可引发严重呼吸窘迫综合征。肺部炎症反应已被认为在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的ALI中起着至关重要的作用[3]。大量炎性细胞因子的产生是肺部炎症反应进展的重要因素[4]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding domain-like receptor protein 3,NLRP3)是细胞内主要的炎症通路，参与先天免疫反应。有研究表明[5]，NLRP3炎性小体及其调控机制在ALI/ARDS的病理过程中发挥了重要作用。由此提示，防治ALI/ARDS的方法之一可能是针对NLRP3炎性小体的靶向治疗。

1 NLRP3炎性小体

1.1 NLRP3炎性小体的结构

炎性小体是由胞浆内模式识别受体(pattern recognition receptor，PRRs)参与组装的多蛋白复合物，是天然免疫系统的重要组成部分。炎性小体能够识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)，包括细菌、病毒、真菌、细胞外ATP、生物晶体(尿酸盐、胆固醇等)和凋亡的细胞成分。NOD样受体家族(nod-like receptors,NLRs)包括14名成员，即NLRP1至NLRP14，其中一些参与炎性小体的组装，包括NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRP6、NLRP7和NLRP12[6]。NLRP3炎性小体是先天免疫系统细胞内多蛋白复合物，主要由NLRs家族成员之一的NLRP3，衔接蛋白凋亡相关斑点蛋白(apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD domain,ASC)和反射蛋白pro-caspase-1组成。 NLRP3主要含有三个结构域：N末端热蛋白结构域(pyrin domain,PYD),主要负责传递危险信号；C末端亮氨酸富集重复域(leucine-rich-repeat domain，LRR)，主要负责识别PAMPs或DAMPs等危险信号；中心段含特异性核苷酸寡聚化结构域(nucleotide binding and oligomerization domain,NOD)，又称NACHT结构域，是炎性小体的主要结构。

1.2 NLRP3炎性小体的功能

当NLRP3被PAMPs和DAMPs激活时，NLRP3发生寡聚化使PYD发生聚合，招募含有PYD和胱天蛋白酶募集结构域(caspase recruitment domain,CARD)的接头蛋白ASC。ASC通过CARD结构域招募pro-caspase-1,促进pro-caspase-1的二聚化和近端诱导的蛋白水解过程，使其变成两个亚基(P10、P20)，从而激活具有酶活性的异二聚体caspase-1，形成活化的NLRP3炎性小体。活化后的NLRP3炎性小体可介导促炎作用的pro-IL-1β和pro-IL-18的剪切成熟，将其加工成为有致炎作用的炎性因子IL-1β和IL-18，并释放至细胞外，进一步启动下游信号通路，最终介导炎症反应发生[7]。

2 NLRP3炎性小体的活化

炎性小体的活化是复杂的，在大多数细胞类型中，微生物刺激并不能直接激活NLRP3炎性小体。而是在ATP、成孔毒素或颗粒物质诱导NLRP3激活之前，需要微生物刺激或细胞因子对巨噬细胞进行预处理，为其活化做准备。经典NLRP3炎性小体的激活主要包括启动和组装活化两个步骤。

2.1 NLRP3炎性小体的启动阶段

NLRP3炎性小体是通过启动NLRP3基因的转录来启动细胞，这是NLRP3炎性小体完全激活的第一个信号步骤。微生物或内源性分子通过启动NLRP3基因的转录来激活并参与Toll样受体4(Toll-like receptor-4,TLR4)信号通路介导的核转录因子-κB(nuclear factor-kappa-B,NF-κB)入核而产生机制，进而调控NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的转录表达，为其激活做准备[8]。有研究表明[9]，AKT作为PI3K的主要下游效应因子，在其激活后调节了许多细胞功能，它能通过激活IKB激酶，促进NF-κB从细胞质释放并向细胞核转移，进而激活靶基因，提高靶蛋白的转录水平。由此提示，PI3K/AKT与NLRP3炎性小体的启动步骤密切相关。

2.2 NLRP3炎性小体的组装和活化阶段

NLRP3炎性小体的激活作为第二个步骤是由ATP、成孔毒素、病毒RNA或颗粒物质引起的，通过DAMPs和PAMPs模式作用于细胞质内的Nod样受体(NOD-like receptor,NLR)作为第二信号，最终介导NLRP3炎性小体各组分(NLRP3、ASC、pro-caspase-1)的组装及活化，完成IL-1β、IL-18等促炎因子的加工及分泌[10]，从而诱导NLRP3-ASC-caspase-1复合物的形成。NLPR3炎性小体的活化方式主要包括离子通道、溶酶体破裂和线粒体损伤三种经典途径。

2.2.1 离子通道活化途径

研究发现[11],在树突状细胞中刺激因子可通过介导Syk-JNK信号通路，促使K+释放，进而促进NLRP3炎性小体被激活。另外，在非经典炎性小体的激活过程中，caspase-1作用于Gasdermin D(GSDMD)蛋白或Pannexin-1(PANX1)膜孔蛋白，使质膜产生穿孔通道或非选择性通道，通过调节细胞内外离子浓度的高低致使NLRP3炎性小体的活化[12]。同时，质膜上的相关受体能够与刺激物结合，在内吞作用下向胞质溶胶中释放应激信号，从而诱导K+外排或内质网Ca2+释放致使NLRP3炎性小体的激活[13]。一般认为，NLRP3不直接与刺激相互作用，而是通过感知细胞内的低K+信号来激活炎性小体。有报道表明[14]，nek7是NLRP3在K+外排作用下被激活的重要偶联蛋白。

2.2.2 溶酶体破裂途径

溶酶体内含有多种水解酶，是一种分解生物大分子(蛋白质、核酸、多糖等)的细胞器，它不仅能分解外界进入细胞内的物质，也能分解细胞自身的局部大分子物质。有研究发现[15],颗粒或晶体物质进入细胞后，会与溶酶体膜透化(lysosomal membrane permeabilization,LMP)和多种溶酶体组织蛋白酶(如组织蛋白酶B等)反应降低溶酶体膜稳定性，破坏溶酶体膜，使溶酶体蛋白水解酶-B(cathepsin-B)进入胞浆内，最终激活NLRP3炎性小体。

2.2.3 线粒体损伤途径

氧化应激是由于活性氧(reactive oxygen species,ROS)的持续产生，使机体的抗氧化防御系统能力超载，导致DNA、蛋白质和脂质损伤而产生的反应。Nrf2作为重要的核转录因子，具有较强的抗氧化活性，已被广泛应用于抑制氧化应激和由此产生的炎症的启动子。当氧化应激发生时，Nrf2进入细胞核内，启动抗氧化酶(SOD、GSH)和抗氧化基因(HO-1、NQ-O1、GCLM)的转录，最终减轻氧化损伤[16]；另外，细菌感染会引起线粒体损伤，并导致线粒体活性氧(mtROS)和线粒体DNA(mtDNA)的累积和释放。线粒体自噬缺陷导致mtROS积累，mtROS诱导NLRP3炎性小体的过度激活，然后触发caspase-1依赖性焦亡。我们之前的研究表明NLRP3炎性小体的激活和肺泡巨噬细胞的焦亡是炎症反应的重要驱动因素[17]，提示NLRP3炎性小体的激活可能与自噬密切相关。

3 脂多糖(LPS)模型

脂多糖(LPS)，又称内毒素，是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要活性成分，其在正常情况下是无毒的，当受到刺激或细菌死亡时释放游离的LPS是有毒的，会引起机体炎症反应(如肺泡细胞病变、肺泡水肿、免疫细胞数量增加等)。LPS被广泛应用于诱导ALI小鼠肺部炎症模型，在动物模型中，暴露于LPS可导致中性粒细胞募集，并增加促炎分子的表达。同时，LPS也是NLRP3炎性小体激活剂，可通过NLRP3炎性小体在LPS诱导的ALI中诱导caspase-1活化和IL-1β成熟。有研究表明[18]，在LPS被TLR4受体识别后，IRAK4和IRAK1被髓样分化因子88(MYD88)信号复合物招募，导致转化生长因子β激酶1(AKT1)、IKK-α、IKK-β的激活，继而引起IκB-α磷酸化降解和NFκB的活化。LPS刺激还促使髓过氧化物酶(MPO)和丙二醛(MDA)的形成，降低抗氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的含量[19]。

4 NLRP3炎性小体与急性肺损伤

如前所述，NLRP3可被多种信号激活，包括PAMPs、DAMPs和细菌毒素，NLRP3的激活导致炎性小体的组装，炎性小体是激活caspase-1的多蛋白复合物，它在蛋白水解成熟和释放促炎细胞因子IL-1β和IL-18过程中是必不可少的。虽然NLRP3炎性小体的激活在驱动急性肺部炎症和帮助清除病毒和细菌感染方面至关重要，但刺激物持续激活NLRP3会导致IL-1β的产生。它增加了流感或其他病毒感染后继发细菌感染的风险，提示NLRP3炎性小体与急性肺损伤的发展密切相关。

4.1 NLRP3炎性小体在ALI中促进炎性细胞因子的产生

当器官不能严格调节NLRP3炎性小体时，机体会产生严重的免疫反应，促炎性细胞因子分泌过多，致使自身免疫性炎症、组织损伤或慢性炎症等多种生理疾病的发生。因此，维持促炎性细胞因子的平衡在治疗ALI中至关重要。IL-1β是关键的促炎细胞因子，不仅导致炎症的发生，更重要的是可以诱导一系列的促炎细胞因子及黏附分子的产生并加重肺部炎症的发展。有实验发现[20]，在脓毒症引发的ALI中，IL-1β、IL-18、TNF-α等炎性因子的表达增高，提示NLRP3炎性小体的激活会促进炎性细胞因子的产生，且它们的表达水平与病情严重程度及病死率呈正相关。此外有文献报道[21],干预高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)是ALI中的重要中介物，NLRP3和ASC/caspase-1/IL-1β信号通路促进HMGB1的产生和释放。上述研究表明，NLRP3炎性小体通过调控促炎细胞因子的分泌来影响ALI的发生和发展。

4.2 NLRP3炎性小体增加肺泡上皮通透性

ALI的生理特性是肺泡-毛细血管膜屏障的破坏，导致非心源性肺水肿的发生，其中蛋白渗出物会淹没肺泡间隙，妨碍气体交换，进而导致呼吸衰竭。越来越多的证据表明[22]，当NLRP3炎性小体被激活时，中性粒细胞也会在肺部积聚并释放促炎细胞因子和中性粒细胞胞外陷阱(NETs)，从而通过NETs来捕获病原体。当肺上皮，特别是Ⅱ型肺泡细胞被这些细胞及其产物破坏后，会导致肺泡毛细血管界面的破坏和微血管通透性的增加。这种情况往往发生于肺炎、胃误吸、吸入烟雾和有毒气体、PM、再灌注和严重脓毒症等因素中。提示，NLRP3炎性小体在ALI中使肺泡上皮的通透性提高。

4.3 NLRP3炎性小体促进中性粒细胞的募集

活化的中性粒细胞可直接诱导内皮损伤，破坏基底膜，导致血管渗漏，最终引起肺水肿。此外，中性粒细胞的减少可明显减轻动物模型中ALI的严重程度。关于NLRP3炎性小体与中性粒细胞募集的关系，有报道称[21]，NLRP3在肺泡巨噬细胞和中性粒细胞中表达明显，而在肺泡上皮中不表达。 NLRP3基因敲除小鼠也能抵抗高氧诱导的ALI和肝脏缺血-再灌注损伤，因为其减少了中性粒细胞的迁移和组织损伤[23]。还有研究发现[24]，NLRP3敲除或caspase-1抑制可以减弱因败血症诱导的肾中性粒细胞的浸润。这些都提示NLRP3炎性小体的过度激活可能会促进ALI中中性粒细胞的募集。

5 小结与展望

新生儿急性肺损伤是临床上常见的新生儿急重症,因此，寻找有效的诊断方式对新生儿来说具有重要意义。有研究发现[25]，血小板活化因子(PAF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肺表面活性蛋白A(SP-A)在新生儿急性肺损伤中均表达异常，提示炎症反应的发生伴随炎症因子的大量释放。临床上，中药被广泛用于治疗ALI/ARDS，不仅褪黑素可通过抑制NLRP3炎性小体的表达，中药成分苍术苷也可通过抑制NLRP3炎症小体被激活，继而减轻脂多糖诱导的ALI[26]，提示中药成分研究可作用于NLRP3/ASC/caspase-1轴，为ALI/ARDS的治疗提供新思路。

本文主要阐述了NLRP3炎性小体的组成和其在ALI/ARDS发生和发展中的作用。大量研究表明NLRP3炎性小体与ALI/ARDS存在紧密联系， NLRP3炎性小体上游和下游通路的任何蛋白及炎性因子的表达失调都可能引起肺部炎症反应。NLRP3炎性小体在不同的ALI模型中被不同的刺激因素激活，可以使pro-caspase-1通过自身酶解形成具有活性的caspase-1，一旦其被激活，caspase-1可以通过剪切的方式活化pro-IL-1β和pro-IL-18，从而使大量成熟的IL-1β和IL-18得以释放， 炎症反应迅速扩大，肺泡上皮通透性增加。 NLRP3是一种重要的炎性小体，NLRP3炎性小体的激活是如何参与ALI的发生，NLRP3多蛋白复合物是否会受到基因等因素的调控，还需进一步研究。未来的研究重点可能在于对NLRP3炎性小体上游分子的探索和对NLRP3炎性小体组装的特异性干预。随着多种针对NLRP3炎性小体的研究被发现，靶向药物抑制NLRP3炎症通路或将成为防治肺部疾病的重要方向。