玛咖中芥子油苷及其降解过程的研究进展

颜穗桐，魏金超，高玉梅，陈芮*

1. 云南师范大学化学化工学院（昆明 650500）；2. 中国科学院化学研究所（北京 100190）

玛咖（Lepidium meyeniiWalp.）是逐渐被人们认识的一种食品补充剂。研究表明，玛咖的主要生物活性成分为芥子油苷（glucosinolates）、玛咖酰胺（macamide）、玛咖烯（macaene）、生物碱（alkaloid）和甾醇（steroid）。玛咖中的芥子油苷及其降解产物——异硫氰酸酯（ITCs）因具有良好的抗肿瘤活性，进而引起人们对玛咖研究的极大兴趣。

芥子油苷，又称为硫代葡萄糖苷。芥子油苷是十字花科植物中广泛存在的一种重要含硫次生代谢产物。从双子叶被子植物的16个科中已鉴定出120余种不同芥子油苷。1970年，Marsh等[1]用X射线分析了芥子油苷的晶体结构后，认为芥子油苷都具有相同的基本结构式，即具有侧链（R）以及和硫连接的β-D-吡喃葡萄糖部分（见图1）。根据其侧链基团R的来源，芥子油苷可分为脂肪族、芳香族和吲哚族3类。

图1 芥子油苷的化学结构

2002年，Dini等[2]和Piacente等[3]先后报道了在玛咖根中能够检测到苄基芥子油苷（benzyl glucosinolate或glucotropaeolin）和甲氧基苄基芥子油苷（methoxybenzyl glucosinolate或glucolimnanthin）等。Huang等[4]研究显示，玛咖中含有9种芥子油苷，其中包括脂肪族、芳香族、吲哚族。

玛咖中总芥子油苷含量最高的部位是新鲜的块根，其次是种子、植株、干燥的块根及新鲜的叶子。Clément等[5]发现玛咖的下胚轴和叶子中均含有脂肪族、芳香族和吲哚族3类芥子油苷。芳香族芥子油苷在玛咖中含量最多，约占总芥子油苷的90%，主要为苄基芥子油苷、3-甲氧基苄基芥子油苷和对羟基苄基芥子油苷（glucosinalbin），其次为脂肪族类芥子油苷，包括5-甲基亚磺酰戊基芥子油苷（glucoalyssin）和4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷（glucoraphnin）。玛咖中吲哚类芥子油苷含量最少，主要为4-羟基吲哚基-3-甲基芥子油苷（glucobrassicin）。

尽管玛咖中均含有脂肪族、芳香族、吲哚族3类芥子油苷，但是不同颜色的玛咖中芥子油苷含量存在很大差异。Meissner等[6]通过对中国和秘鲁2个产地不同颜色的玛咖中芥子油苷种类及含量进行试验后发现，不同颜色、不同种植地区的玛咖中芥子油苷种类及含量有显著差异。这可能是由于玛咖的种类及生长环境不同导致，其中土壤的质地、pH及可利用的有机成分都可能是造成差异的原因。此外，干燥方法和处理条件对玛咖中芥子油苷的含量也会产生很大影响[7]。

1 芥子油苷的提取、纯化及检测

1.1 芥子油苷的提取及纯化

1.1.1 提取

芥子油苷的提取方法主要有微波法、水浴法及溶剂热提法[8]。玛咖中芥子油苷的提取一般使用溶剂热提法。提取芥子油苷时，一般选用对芥子油苷有较大溶解度的溶剂来提高提取效率。通常选择水、乙醇、甲醇等作为提取芥子油苷的溶剂。郝利民等[9]选用水、甲醇、乙醇、正己烷4种有机溶剂分别作为提取剂对玛咖中芥子油苷进行提取。通过比较提取率，得出甲醇作为溶剂提取效率最高，水次之，正己烷最弱的结论。

1.1.2 纯化

对粗提得到的芥子油苷通常采用阴离子交换柱等传统的柱层析方法进行纯化处理。普遍选择的层析柱填料包括酸性氧化铝、大孔强碱性阴离子交换树脂或者DEAE Sephadex A-25葡聚糖凝胶等。采用这些柱层析进行纯化，效果较好，得到的芥子油苷样品纯度较高。

吴谋成等[10]曾利用酸性氧化铝作为填料，硝酸钾为洗脱剂，得到芥子油苷的粗结晶。周锦兰等[11]采用酸性氧化铝色谱柱及反相C18硅胶柱相结合的方法对芥子油苷进行提纯。这种方法具有便捷、成本较低的特点，适于分离提纯菜籽中的芥子油苷。Wang等[12]通过对3种活性炭及5种大孔树脂进行吸附解吸试验以筛选适合提纯芥子油苷的填料。结果表明，由于芥子油苷分子中的阴离子基团—SO3-能与D261大孔阴离子树脂表面的阳离子季胺官能团发生特异性反应，进而能够更好地吸附芥子油苷，因此D261大孔阴离子树脂更适合芥子油苷的提纯。在此基础上，采用制备型液相色谱进一步分离纯化即可获得纯度更高的芥子油苷样品。

1.2 芥子油苷的分离鉴别

分离鉴别芥子油苷的方法有纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）及核磁共振波谱（NMR）等。

纸色谱与薄层色谱法主要在20世纪70年代前被广泛使用。Ettinger和Lundeen首先利用薄层色谱法从植物中分离得到烯丙基芥子油苷（Sinigrin），并给出芥子油苷的一般结构。由于薄层色谱法分离出芥子油苷的种类有限，且分离效果不够理想，因此这种方法现已不再被广泛采用。

GC-MS和LC-MS是分离鉴别玛咖中芥子油苷最常用的方法。Foerster等[13]报道采用气相色谱（GC）法分离检测芥子油苷。由于GC的检测对象是沸点低于500 ℃、热稳定性好、相对分子质量＜400的易挥发性物质，而芥子油苷在玛咖中主要是以盐的形式存在，熔、沸点较高，因而不能直接利用GC进行测定。进行GC测定前，需要将芥子油苷酶解转化为异硫氰酸盐等易挥发的物质。采用GC-MS定性是通过比较ITCs标准品与芥子油苷酶解得到的ITCs的保留时间，并结合MS给出的分子量及碎片离子信息等对芥子油苷结构进行推断。由于吲哚类芥子油苷对温度极其敏感，如在较低温度下，这类芥子油苷的衍生化反应不完全，温度升高时，又易分解，因此采用GC-MS分析吲哚类芥子油苷的结果不理想[14]。

与GC不同，采用高效液相色谱（HPLC）法分析样品时，不受试样的挥发性及热稳定性的限制，因此HPLC应用范围广。HPLC-MS具有两种分析方法的特点，不仅可以对目标化合物的相对分子质量、离子碎片及物质结构进行综合分析，同时还具有高效、抗干扰能力强的特点，已成为天然产物分离、分析、结构鉴定的强有力工具。芥子油苷极性大，直接采用反相C18柱进行分离时保留能力差，不利于有效的分离。因此在使用HPLC对芥子油苷进行分析时，需要采用硫酸酯酶对芥子油苷进行脱硫处理得到脱硫芥子油苷（desulphation）。经脱硫处理后，与氮原子相连的硫酸根被氢氧根所取代，产物的极性显著降低[15]，这时候进行分析能得到较好的分离效果。Zhang等[16]通过对芥子油苷进行脱硫处理，得到脱硫芥子油苷。采用HPLC结合高效液相色谱-电喷雾质谱仪（HPLC-ESIMS）根据带负电荷的分子离子峰、色谱图上的保留时间及质谱给出的碎片离子信息对脱硫芥子油苷进行分析，鉴别出所对应的芥子油苷种类。

1.3 芥子油苷的含量测定

测定芥子油苷含量的方法可为间接测量法和直接测量法。

间接测量法是将芥子油苷酶解，对酶解后的产物进行定量分析，如通过测定ITCs、硫氰酸酯等的含量，可间接测定芥子油苷的含量。由于影响酶解过程的因素较多，导致测量结果波动较大，准确度不高。GC对芥子油苷的定量分析方法就是通过内标法或外标法，以ITCs为标准品，通过计算芥子油苷水解得到的ITCs含量间接求出芥子油苷含量。

直接测量法是通过直接测定总芥子油苷的含量或者采用分量法对样品中芥子油苷的每一种组分进行分析。该法主要用于分析每种样品中芥子油苷组成的差异[17]。顾振新等[18]提供了一种测定植物中芥子油苷总含量的方法，即：将经粉碎的植物原料用乙酸盐缓冲液匀浆；匀浆液经高温水浴灭酶后，依次添加聚乙烯吡咯烷酮、醋酸铅混合液及饱和硫酸钠溶液；振荡混匀后离心制得芥子油苷提取液；芥子油苷提取液分别采用碱降解、37%浓盐酸中和；中和液再与铁氰化钾溶液反应后，用紫外-可见分光光度计在420 nm处测定铁氰化钾吸光度的减少量，以烯丙基芥子油苷为标准品制作标准曲线，经计算得到植物中总芥子油苷含量。

总芥子油苷含量还可利用芥子油苷与氯化钯反应生成有色芥子油苷钯的原理通过分光光度法在540 nm下进行比色定量[19]。该方法的缺点是显色时间长，在复杂的体系下受温度和样品芥子油苷浓度影响较大，进而产生较大误差。

HPLC可通过峰面积和样品量的线性关系来对芥子油苷进行定量。该方法重现性好、精密度高，并且能同时检测总芥子油苷及单个芥子油苷含量。缺点是前期硫酸酯酶处理过程复杂、耗时、设备价格昂贵等。

2 芥子油苷降解过程与产物

用于降解芥子油苷的植物糖基化酶是黑芥子酶（myrosinase）。黑芥子酶又称为β-硫代葡萄糖苷酶，在植物体内一般以二聚体的形式存在。黑芥子酶是较为稳定的一类酶，能在pH 5～8的环境下保持活性[20]。在植物中黑芥子酶不是单独存在的，它通常与芥子油苷共同构成特殊的底物酶系统[21]。

2.1 芥子油苷的降解过程

2.1.1 芥子油苷的酶降解

黑芥子酶和芥子油苷位于幼苗植物细胞的不同区域。黑芥子酶定位于细胞的特定蛋白体中，而芥子油苷分布于细胞液中。植物组织受到损伤时，黑芥子酶细胞中的黑芥子酶将被释放，并与芥子油苷结合[22]。芥子油苷降解后产生1分子葡萄糖和糖苷配基，糖苷配基不稳定，随即重组形成生物活性化合物，如腈、硫氰酸盐和异硫氰酸盐、恶唑烷-2-硫酮等物质[23]，芥子油苷酶降解产物的结构如图2所示。芥子油苷则被认为是异硫氰酸盐稳定的水溶性前体。

图2 芥子油苷酶解过程的产物

2.1.2 影响酶降解的因素

芥子油苷降解得到的产物有些是对人体有害的，如腈类物质；另一些物质则是对人体有益的，如具有抗癌作用的硫氰酸酯类物质。体系pH、侧链基团R及植物种类等因素会对酶降解产物产生影响。

一般情况下，在pH 5～8的中性体系中，芥子油苷经过酶水解生成糖苷配基和D-葡萄糖2种初产物，不稳定的糖苷配基发生Lossen重排，形成异硫氰酸盐；在pH 2～5的酸性体系中，中间产物易发生脱硫反应，芥子油苷主要转化为腈类化合物；在碱性条件下，黑芥子酶易失活，中间产物将生成硫代氰酸盐[24]。

除此之外，结构中的侧链基团R会对降解产物的结构产生影响。基团R若为甲基、烯丙基、3-丁烯基、苄基或间甲氧基苄基时，其酶解易于产生具有相应挥发性的ITCs。对于大部分芥子油苷而言，酶解都能形成较为稳定的ITCs。而侧链中含有β-羟基时，酶解会形成不稳定的ITCs，后环化形成硫代恶唑烷酮。

2.1.3 芥子油苷的无酶降解

芥子油苷既能够在黑芥子酶参与下进行降解，也能在高温高压、无黑芥子酶参与的情况下发生降解。一般情况下，无酶降解的产物为腈类物质及ITCs[25]。降解的产物及反应速度受反应体系中温度、压强、含水量、反应化学试剂以及是否有过渡金属离子参与等因素的影响。如高温条件下，无酶降解的产物以腈类物质为主；体系含水量降低时，降解速度会变慢。

3 芥子油苷及其降解产物的生理活性

玛咖独特、刺鼻的味道主要来源于芥子油苷降解得到的ITCs[26]。玛咖中芥子油苷的降解产物具有生理活性如下：

3.1 杀虫、除菌

芥子油苷酶系统是植物的一种化学防御系统。芥子油苷被黑芥子酶降解后，得到的最常见的一类水解产物是ITCs。ITCs在十字花科植物化学预防机制中起主要作用。ITCs对于不以十字花科为食的昆虫有剧毒。因此芥子油苷可以抑制真菌、微生物的生长，可作为天然杀虫剂被使用[27]。

3.2 抗肿瘤

芥子油苷及其分解产物因为具有抗癌活性而引起学者们的广泛关注。芥子油苷在黑芥子酶的蛋白催化下产生最具有活性的水解产物ITCs。在抑制肿瘤过程中，ITCs通过诱导泛醌还原酶的活性成为致癌物的阻断剂，而对正常细胞和淋巴系统均无害。

玛咖之所以表现出很强的抑制癌症的功能，是由于其含有芥子油苷，尤其是玛咖中含量最高的苄基芥子油苷和甲氧基苄基芥子油苷水解得到的芳香族ITCs所起的作用[28]。

4 结语与展望

芥子油苷是玛咖中一种重要的次生代谢物。芥子油苷及其降解产物ITCs对玛咖的抗肿瘤活性起着重要作用。随着科技的发展以及分析检测技术的提高，人们对芥子油苷的研究逐渐深入，特别是对芥子油苷的提取、纯化、鉴别、定量及其降解过程均有深入研究。

由于影响芥子油苷种类及含量的因素很多，且芥子油苷的降解过程很复杂，因此在对芥子油苷的研究过程中，仍存在很多急需解决的问题。鉴于芥子油苷及其降解产物具有杀虫、除菌、抗肿瘤等优异的生理活性，如何提高芥子油苷的提取效率仍是研究热点之一。芥子油苷降解过程中会产生对人体有害的腈类物质，研究芥子油苷降解过程及影响因素，通过改变控制条件降低芥子油苷降解过程中产生的腈类物质也是芥子油苷研究的重点。此外，提高玛咖中芥子油苷的利用效率等均是具有重要价值的芥子油苷研究方向。