基于二氧化锆纳米微粒的电化学免疫传感研究

陈小燕， 宋 琳， 朱蕾静， 黄卓敏， 安雅睿*

（上海理工大学 理学院，上海 200093）

人免疫球蛋白G（HIgG）作为人血清中含量最高的免疫球蛋白，可作为靶标抗原被用于各种慢性感染、慢性肝病、肝癌、淋巴瘤和某些自身免疫性疾病比如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、分泌型多发性骨髓瘤以及免疫缺陷病的监测与诊断[1]。因此，探索可用于HIgG灵敏检测的分析方法在多种疾病的临床研究中具有重要意义。目前常见的检测HIgG的方法有荧光法、放射免疫测定法和酶联免疫吸附测定法，但这些方法成本昂贵，操作复杂，难以实现高效准确测定HIgG。电化学免疫传感法是近几年来兴起的一种检测方法，由于其操作简便、成本低廉、稳定性好、重现性较好等优点，在人免疫球蛋白检测领域受到广泛关注[2-3]。张洁课题组利用Bi2MoO6材料制备了一种超灵敏的电化学免疫传感器用于检测HIgG，检测限低至4 pg/mL[4]，Thitirat Putnin等人设计了一种无标记的电化学免疫传感器，其具有较高的灵敏度，线性范围为1.0～50 ng/mL[5]。

受现有技术启发，本文利用溶胶-凝胶的方法合成出二氧化锆纳米微粒（ZrO2NPs），并通过表面修饰氨基官能团的方法使ZrO2NPs可被用于固定人免疫球蛋白抗体。并利用具有良好导电性的多壁碳纳米管与金纳米微粒构成的纳米复合材料作为基底修饰电极表面，以期制得的免疫传感器具有低检测限、宽线性检测范围、高稳定性、高选择性的优良性能。

1 实验

1.1 试剂

人IgG、山羊抗人IgG购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司，（3-氨丙基）三乙氧基硅烷（APTES）、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基丁二酰亚胺（NHS）购于Sigma-Aldrich，氧氯化锆八水（ZrOCl2‧8H2O）、氯金酸（HAuCl4）、氨水、牛血清白蛋白（BSA）、铁氰化钾、亚铁氰化钾三水、壳聚糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠购于国药集团化学试剂有限公司，多壁碳纳米管购于中国科学院成都有机化学有限公司。

1.2 仪器

电化学工作站（上海辰华仪器公司的CHI660E），数控加热搅拌器（德国WIGGENS公司的WH220 PLUS），电阻炉（上海意丰电炉有限公司的YFX9/130-YC）。

1.3 合成并氨基功能化ZrO2NPs

ZrO2NPs的合成工作具体步骤如下[6]。将浓度为0.03 M的ZrOCl2溶液在搅拌下水解2 h，然后向溶液中逐滴加入氨水直至溶液pH变为3.0，此时，溶液变浑浊并产生白色凝胶。随后，得到的凝胶以10 000 r/min的转速离心6 min并用去离子水冲洗，重复4次，离心清洗后的凝胶放入鼓风干燥箱200℃干燥过夜。然后，将干燥后的固体研磨并放入马弗炉450℃煅烧6 h，最终得到纯的ZrO2NPs。

ZrO2NPs的氨基功能化具体实验步骤如下[7]。将20 mg制备好的ZrO2NPs加入4 mL异丙醇超声分散后，加入40 μL 98%的APTES并在室温下（25℃）以350 r/min搅拌48 h。将得到的悬浊液离心分离并以去离子水彻底冲洗后，得到的白色固体（氨基功能化的ZrO2NPs，APTES@ZrO2NPs）置于60℃干燥12 h。

1.4 合成金纳米微粒-壳聚糖-多壁碳纳米管纳米复合材料

金纳米微粒-壳聚糖-多壁碳纳米管（AuNPs-CHIT-MWCNTs）纳米复合材料的合成过程如下[8]。用将壳聚糖粉末溶解在体积分数为1.0%的醋酸溶液中并在室温下缓慢搅拌1 h至完全溶解，得到0.5%（wt）壳聚糖溶液。随后，在制得的壳聚糖溶液中加入0.5 mL 1 mM氯金酸溶液并在室温下剧烈搅拌30 min。将该混合液在搅拌下放置于80℃反应1 h，得到AuNPs-CHIT溶液。最后，将0.5 mg MWCNTs加入1 mL AuNPs-CHIT溶液并超声2 h获得一个均匀且稳定的悬浊液，即AuNPs-CHIT-MWCNTs纳米复合材料分散液。

1.5 免疫传感器的制备

在进行电极修饰前，依次以粒径为1.0、0.3和0.05 μm的氧化铝粉末抛光处理玻碳电极（GCE，直径3 mm）[9]。首先将4 μL AuNPs-CHIT-MWCNTs滴涂在电极表面并室温干燥1 h，然后将5 μL APTES@ZrO2NPs溶液滴涂在电极表面并室温干燥1 h，最后在室温下（25℃）将电极浸泡在EDC/NHS活化的山羊抗人IgG溶液中4 h后，取出电极并用去离子水冲洗电极表面后，将电极以BSA溶液（1%，w/V）封闭30 min防止发生非特异性吸附。将制备好的电化学免疫传感器（BSA/Ab/ZrO2NPs/AuNPs-CHIT-MWCNTs/GCE）储存在4℃保存备用。图1描述了电化学免疫传感器的构建原理。

图1 电化学免疫传感器的构建原理图[9]

2 结果与讨论

2.1 AuNPs-CHIT-MWCNTs纳米复合材料的表征

多壁碳纳米管（MWCNTs）、金纳米微粒（AuNPs）及金纳米微粒-壳聚糖-多壁碳纳米管（AuNPs-CHIT-MWCNTs）纳米复合材料的形貌由扫描电子显微镜（SEM）和场发射透射电子显微镜（FETEM）表征且结果如图2所示。由图2a可知，MWCNTs的管径大约20 nm，且从插图可观察到其明显的多层管壁和中空管腔结构。AuNPs具有较规则的球状结构且粒径分布均匀，平均粒径约为20 nm（图2b）。将MWCNTs与AuNPs-CHIT均匀混合并超声分散后，可观察到大量AuNPs均匀地附着在MWCNTs的外管壁上形成一种纳米复合材料（图2c），这种复合结构的存在使得该纳米复合材料具有极好的导电性，从而可实现免疫传感器灵敏度的大幅提高。

图2 FETEM图：（a）MWCNTs；（b）AuNPs；（c）AuNPs-CHIT-MWCNTs的SEM图

2.2 ZrO2NPs的表征

通过ZrO2NPs的EDS能谱图（图3a），证实了纳米微粒中只存在锆、氧元素，而不含其它元素。从合成的ZrO2NPs的XRD测试结果（图3b）可以观察到，由于纳米晶相具有较小的晶体尺寸，导致XRD图中出现宽的衍射峰[10]。位于28.17°、31.47°、34.16°、40.72°、49.27°和50.12°的衍射峰与单斜晶型ZrO2（JCPDS 37-1484）的(ī11)、(111)、(200)、(ī12)、(220)、(022)晶面一一对应，表明了单斜晶型的ZrO2NPs被成功合成[7]。利用衍射峰最强峰11)的半高宽，通过Scherer公式[10]计算得到晶体的平均粒径大约为12 nm，这与通过透射电子显微镜观察到的微粒尺寸基本相符。

图3 ZrO2NPs的EDS图（a），XRD图（b）

如图4所示，ZrO2NPs 和 APTES@ZrO2NPs的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）被用于表征氨基功能化前后粒子表面化学键的变化。两个样品光谱图中的540 cm-1处都出现了对应Zr-O对称伸缩振动的特征吸收带，而且，由于纳米微粒表面含有羟基和吸附的水分子，两个样品在大约3430 cm-1的位置都显示了一个宽的吸收带[11]。在APTES@ZrO2NPs的谱图中，出现在950 cm-1和1250 cm-1位置的吸收带分别对应于Si-O-Zr和Si-O-C的伸缩振动[7]。此外，位于1566 cm-1处的吸收带是由APTES分子中氨基的剪式振动产生的，尽管由于与羟基的伸缩振动重叠而无法在3296 cm-1处显示出吸收带，但是在3366 cm-1位置出现的吸收带仍属于N-H的对称伸缩振动[1,7]。所有这些新增的吸收带和一个在2800～3000 cm-1的吸收带都表明了APTES分子已经被成功固定在ZrO2NPs表面，因此成功形成了氨基功能化的纳米微粒[1]。

图4 ZrO2NPs和APTES@ZrO2NPs的FT-IR图

2.3 免疫传感器的电化学表征

在含有5.0 mM [Fe(CN)6]3-/4-和0.1 M KCl的0.01 M PBS溶液（pH＝7.0）中进行循环伏安（CV）测试，可实现电极表面逐步修饰过程的监测。如图5所示，裸GCE（曲线a）在电极表面修饰了AuNPs-CHIT-MWCNTs纳米复合材料得到AuNPs-CHIT-MWCNTs/GCE（曲线b）后，得到了相比于裸GCE更大的电流响应。当ZrO2NPs被滴涂在修饰电极表面后，由于弱导电性的ZrO2NPs阻碍了电子转移，使得电极的峰电流明显降低（曲线c）。当人IgG抗体（曲线d）、BSA（曲线e）、人IgG进行孵育反应（曲线f）后，修饰电极的峰电流因为蛋白质会在一定程度上阻碍电子的转移而逐渐降低。这些结果表明电极的逐步修饰过程被成功实现。

图5 电化学免疫传感器修饰过程的CV表征图

2.4 免疫传感器对人IgG的电化学测定

在最优实验条件下，利用DPV测定一系列不同浓度的人IgG溶液，实现了对构建的免疫传感器分析性能的评价。如图6a所示，免疫传感器的峰电流响应随着人IgG溶液浓度的增加而降低，且从图6b可以看出，电流峰值与人IgG浓度的对数值在0.01～800.0 ng/mL 和800.0～6 000.0 ng/mL范围内分别具有线性关系，线性校正曲线的拟合方程分别为Ip＝－4.856 36 logc(ng/mL)＋108.61210（R2＝0.999 4）和Ip＝－23.457 99 logc(ng/mL)＋161.632 95（R2＝0.997 4），得到检测限为3.0 pg/mL（S/N＝3）。之所以能实现如此低的检测限和宽的线性检测范围，归结于以下两个因素：1）AuNPs-CHIT-MWCNTs纳米复合材料极好的导电性促进了电子转移；2）ZrO2NPs的多孔结构和良好生物相容性有利于固定更多的抗体。

图6 电化学免疫传感器检测0.01、0.1、1、10、50、100、200、400、800、1000、1500、 2000、2500、4000、5000、6000 ng/mL人IgG的（a）DPV电流响应（曲线a～p）； （b）DPV电流峰值与对应浓度对数值的线性校正曲线

2.5 选择性、重现性和稳定性

为了探究制备的免疫传感器的选择性，利用几种潜在干扰物包括抗坏血酸（AA）、葡萄糖（Glu）、尿酸（UA）和BSA在最优实验条件下评估选择性。可以看出含有目标物质的待测物具有明显的电流下降，说明该免疫传感器具有令人满意的选择性（图7a）。

检测的重现性是衡量传感器性能的一个重要指标。利用在相同的实验条件下制得的五根修饰电极进行平行实验，五次检测结果的相对标准偏差（RSD）为4.8%，表明该电化学免疫传感器具有较好的重现性。针对稳定性的研究工作是通过将制备好的电化学免疫传感器置于PBS溶液（pH＝7.0）上方并保存在4℃的冰箱中，每隔五天将其取出检测50 ng/mL人IgG，30天后，测得的电流大小与初始值相比差别不大（图7b），实验结果表明制备的免疫传感器具有良好的稳定性。

图7 电化学免疫传感器（a）对AA，Glu，UA，BSA，IgG的选择性； （b）4℃保存0、5、10、15、20、25、30天后的DPV电流峰值对比图

3 结论

本工作中，二氧化锆纳米微粒、金纳米微粒、壳聚糖和多壁碳纳米管的纳米复合材料被用于制备一种简单灵敏的免标记人IgG电化学免疫传感器。该传感器表现出针对人IgG检测的优异性能，在最佳检测条件下，对人IgG的线性检测范围为0.01～800.0 ng/mL、800.0～6 000.0 ng/mL，检测限为3.0 pg/mL，具有较好的检测优势，该免疫传感器还具有良好的选择性、重现性和稳定性，具备一定的实际应用潜力。另外，基于该免疫传感器简单的构造和良好的检测性能，可通过替换相应的抗体实现针对其它蛋白质抗原的检测。