瑞士乳杆菌的筛选与应用

王昊乾，马玉珠，赵景娜，刘文俊，陈永福，孙天松

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室农业农村部奶制品加工重点实验室内蒙古自治区乳品生物技术与工程重点实验室，呼和浩特 010018）

0 引言

活性乳酸菌饮料中的乳酸菌必须具有良好的发酵及益生特性并赋予产品良好感官品质[1]。瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus，L.helveticus）具有公认的安全性和益生特性[2-3]，被应用于多种发酵乳制品当中[4-6]。L.helveticus独特的蛋白水解体系能够对乳酪蛋白进行分解，从而释放生物活性肽，如抗高血压肽（Val-Pro-Pro（VPP）、Ile-Pro-Pro（IPP））和具有抑制血管紧张素转换酶（ACE）活性的肽，从而达到降血压的功效[7-8]。ZHOU[9]等研究表明L.helveticus H 9具有较强的产酸能力及蛋白水解能力，并能显著抑制发酵乳血管紧张素转化酶（ACE）的活性。大多L.helveticus具有调节肠道菌群结构和促进宿主健康的作用[10-13]。

本文以自然发酵乳制品来源的194株L.helveticus为研究对象，通过对其发酵特性、胃肠液耐受性以及贮藏稳定性等方面进行筛选，得到一株适用于活性乳酸菌饮料生产的优良L.helveticus菌株。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

本研究所用的194株L.helveticus均由内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库提供，分离自青海（10株）、西藏（15株）、蒙古国（56株）、甘肃（14株）、新疆（37株）、四川（13株）、内蒙古（33株）以及云南（16株）地区的传统发酵食品中。对照菌株为L.paracasei Lc-01，购自丹麦科汉森公司。

1.2 主要试剂与设备

脱脂乳粉，新西兰恒天然；胃蛋白酶（Pepsin 3800 U/mg），Chembase公司；胆盐（Oxgall），Dehydrated Fresh Bile，BD公司；M RS培养基：植物蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、Tween80、磷酸二氢钾、无水乙酸钠、柠檬酸三胺、硫酸镁、硫酸锰，琼脂（固体培养基需加），均来自来自国产试剂公司。

显微镜（BX 50），OLYMPUS；高速冷冻离心机（GL-20B型）、紫外分光光度计（U-170，日本岛津；全自动高压灭菌锅（HA-300MⅢ型），RAYAMA；全自动干热灭菌锅（SP-650型），DVANTEC；p H计（雷磁p HSJ-3F），上海精密科学仪器有限公司；无菌工作台（ZHJH-C1112）；恒温培养箱（STAC-S45F）；恒温水浴锅（95-013）日本；高压均质机（SRH 60-70），上海申鹿均质机有限公司。

1.3 方法

1.3.1 L.helveticus的初步筛选

将194株L.helveticus在脱脂乳培养基中活化至第2代，以2%接种于10%的脱脂乳中，于37℃培养24 h。

p H值的测定：使用p H计直接测定发酵乳的p H值。

滴定酸度的测定：根据GB5009.239，取10 g发酵乳，加20 mL的蒸馏水，2滴酚酞指示剂，混匀，用0.1 mol/L标准NaOH溶液滴定；滴定酸度（吉尔涅尔度，°T）为100 g发酵乳样品消耗0.1 mol/L NaOH溶液的毫升数，消耗1 mL，0.1 mol/L NaOH即为1°T。

1.3.2 复筛菌株对人工胃肠液及胆盐的耐受性

1.3.2.1 菌株对人工胃肠液的耐受性

人工胃液：将PBS灭菌后，用HCL（1mol/L）调节p H值至2.5，加入质量浓度为3.5 g/L胃蛋白酶，用已灭菌的0.22μm滤膜过滤除菌，制成模拟人工胃液，备用。

人工肠液：将PBS灭菌后，用NaOH调节p H值至8.0，加入0.1%胰蛋白酶和1.8%牛胆盐，用已灭菌的0.22μm滤膜过滤除菌，制成模拟人工肠液，备用。

将初筛获得的菌株于MRS培养基中活化，传代2次，用pbs（p H 7.0）洗菌2次后，取0.5 mL菌液加入到4.5 mL模拟人工胃液中，37℃水浴3 h，分别于0 h和3 h用MRS琼脂培养基倾注法计活菌数。取0.5 mL已消化3 h的人工含菌胃液加入到4.5 mL的人工肠液中，继续于37℃水浴培养，分别于0、4 h和8 h计活菌数，每个样品做3个平行[14]。菌株存活率的计算方法为

存活率=Log N1/Log N0

式中：N1为菌株经人工胃肠液处理后的活菌数,N0为菌株初始活菌数。

1.3.2.2 菌株对胆盐的耐受性

将活化好的菌株按1%接种量分别接种于含0.3%胆盐和不含胆盐的MRS培养基中，37℃培养，每小时取样于620 nm处测定吸光值，直到加胆盐和不加胆盐菌液的OD 620值增加0.3个单位以上为止，并计算菌株在不含胆盐和含胆盐培养基中OD620增加0.3个单位所需时间的差值，即为延滞时间（LT，LagTime）。

1.3.3 活性乳酸菌饮料的贮藏稳定性及感官评价

复筛得到的L.helveticus与对照菌株L.casei Lc-01（Lc-01）共同制备活性乳酸菌饮料，并对其贮藏稳定性，风味物质以及感官品质进行研究。

1.3.3.1 活性乳酸菌饮料的贮藏稳定性

菌株按5×106mL-1的接种量接种于褐变脱脂乳中，37℃发酵至滴定酸度（TA）为200°T，取出后急冷，将白砂糖溶解于蒸馏水中，95℃灭菌5 min，冷却至20℃后，按照发酵乳、白砂糖和蒸馏水25∶13∶62的比例混合配制成蛋白质质量分数不低于1%的活性乳酸菌饮料。在4℃贮藏下，分别于0，7，14，21和28 d取样测定p H值、滴定酸度、活菌数，并进行感官评价。

p H值和滴定酸度的测定方法参照1.3.1。

活菌数的测定：将活性乳酸菌饮料梯度稀释至合适梯度，采用MRS琼脂培养基平板倾注法，待凝固后于37℃恒温培养箱中培养48 h，计菌落总数。

感官评价：选择具有乳清饮料品尝经验的25名研究人员对益生菌发酵乳饮料的口感、滋味、香气和状态进行品评，并按照评定标准表1进行打分，评定结果取平均值。

表1 感官评定标准

1.4 数据处理及统计学分析

试验中各指标均为3个平行，试验数据用平均值±标准偏差表示。使用SPSS 22.0软件进行数据分析，使用GraphPad prism 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 L.helveticus的初筛结果

菌株的产酸特性是筛选发酵剂菌种最重要的指标之一，菌株在一定时间内使发酵乳p H值下降的程度不仅体现了菌株的生长和产酸特性，还影响着工业化生产成本[15]。194株L.helveticus中有96株菌的发酵乳在发酵24 h后的p H值小于4.0，产酸能力较强。如图1所示，96株L.helveticus发酵乳的p H值在3.27～5.64之间，滴定酸度在121.57～278.9°T之间，其中IMAU 20111发酵乳的 p H 值最低，为 3.27；IMAU 20280发酵乳的滴定酸度最低，为278.9°T。鲍志宁等[16]在对L.helveticus（Lh134）和干酪乳杆菌（Lc134）的发酵特性进行研究时结果表明，L.helveticus（Lh134）在脱脂乳中的发酵速度比干酪乳杆菌（Lc134）更快，具备较强的产酸能力。此外，有98株L.helveticus发酵乳p H值在发酵24 h后仍在4.0以上。由此可见，自然发酵乳制品来源的L.helveticus在产酸能力方面体现出很大程度上的菌株依赖性。

2.2 复筛菌株对人工胃肠液及胆盐的耐受性

2.2.1 L.helveticus对人工胃肠液的耐受性

益生菌能够在人体内发挥益生作用的前提是其能够在胃肠液以及胆盐的环境下保持活性，因此对L.helveticus进行人工胃肠液耐受性试验是益生菌筛选的必要条件[17-18]。

复筛的菌株根据其分离地及分离源的不同选择24株进行人工胃肠液及胆盐耐受性试验，试验结果如表2所示。L.helveticus IMAU 10049对人工胃液和肠液的耐受性最好，分别为（98.93±1.07）%和（96.93±0.39）%；L.helveticus IMAU 30040耐受性次之，达到（95.67±1.39）%和（95.00±0.43）%；L.helveticus IMAU 40086也表现出较高的胃肠液耐受性，分别为（99.17±0.83）%和（70.53±1.66）%。陈明等[19]对L.casei IMAU 60149进行模拟胃肠液耐受性的试验结果表明，在p H=2.5的人工胃液中处理3 h的存活率为90.60%，在p H=8.0的人工肠液中处理8 h后的存活率为71.35%，耐受能力低于本试验中的L.helveticus IMAU 10049、IMAU 30040和IMAU 40086。

表2 L.helveticus对人工胃肠液的耐受性%

2.2.2 L.helveticus对胆盐的耐受性

24株L.helveticus对胆盐耐受性的结果如表3所示，仅有10株菌在胆盐耐受性试验中的延滞时间少于7 h，其中IMAU 80322延滞时间最短，为0.22±0.04 h，表现出最强的胆盐耐受性。周靖等[20]对应用于褐色活性乳饮料中的L.casei筛选时进行胆盐耐受性试验，结果表明L.casei IM AU 60143、IMAU 70020和IMAU 10510的延滞时间分别为0.34±0.07 h，0.60±0.04 h，0.54±0.06 h，均低于L.helveticus IMAU 80322。菌株IMAU 40086、IMAU 80872的延滞时间小于1 h，分别为0.55±0.02 h和0.93±0.09 h，具有较强胃肠液耐受性的菌株IMAU 30040的胆盐耐受性也较好，延滞时间为2.44±0.28 h。胆盐难受性是菌种在小肠中是否具有代谢活性以及能否定植的重要指标[21]。综合考虑24株L.helveticus对人工胃肠液和胆盐的耐受性结果，选择L.helveticus IMAU 40086和IMAU 30040进入下一步试验。

表3 L.helveticus对胆盐的耐受性h

2.3 活性乳酸菌饮料的贮藏稳定性

2.3.1 发酵时间

发酵时间是发酵剂筛选的重要指标，较短的发酵时间可避免微生物感染风险，还能够降低工业化生产成本[22]。L.helveticus IMAU 30040、IMAU 40086和对照菌株L.paracasei Lc-01均按5×106mL-1的接种量接种于褐变脱脂乳中，于37℃恒温培养箱中发酵，发酵至滴定酸度为200°T，发酵时间见表4。L.helveticus IMAU 30040、IMAU 40086的发酵活性乳饮料发酵时间分别为34 h和17 h，发酵时间远少于对照菌株Lc-01的68 h，CHEN等[8]筛选具有降血压功效的L.helveticus时结果表明，249株自然发酵乳制品来源的L.helveticus的平均发酵时间为20.1±7.8 h，本研究中菌株IMAU 40086时间低于平均值，在工业化应用中可以显著缩短发酵时间，具有较好的应用潜力。

表4 发酵时间

2.3.2 贮藏期间的后酸化程度及活菌数的变化

采用L.helveticus IMAU 30040、IMAU 40086与对照菌株Lc-01制备的活性乳酸菌饮料在贮藏期间的p H值、滴定酸度和活菌数变化情况反映了菌株的后酸化程度和菌株存活情况，对于发酵乳制品在贮藏期间的稳定性具有重要的参考意义，结果如图2和图3所示。

发酵乳制品在贮藏、运输和销售的一系列过程中，活菌继续发酵导致发酵乳酸度下降现象称为后酸化，较好的发酵剂菌株应具备弱后酸化能力[23]，如图2（a）所示L.helveticus IMAU 40086和IMAU 30040在4℃贮藏过程中酸度上升，L.helveticus IMAU 40086、IMAU 30040及对照菌株的滴定酸度在贮藏期间变化均显著（P＜0.05）。如图2（b）所示添加L.helveticus IMAU 30040和IMAU 40086和对照菌株L.paracasei Lc-01活性乳酸菌饮料的p H值在贮藏期间呈降低趋势，但在28 d贮藏过程中的差异并不显著，因此不会使饮料有的严重后酸化和过酸口感。

3组活性乳酸菌饮料贮藏期间活菌数的变化见图3所示。L.helveticus IMAU 30040和对照菌株的活菌数在7 d时达到最大，活菌数分别为（6.67±0.31）×108m L-1和（3.84±0.08）×108mL-1，7 d后逐渐降低，L.helveticus IMAU 40086的活菌数在贮藏期间内持续下降。贮藏28 d后，L.helveticus IMAU 30040，IMAU 40086和对照菌株活菌数均在108mL-1以上，分别为（1.72±0.11）×108m L-1，（1.24±0.14）×108mL-1和（4.49±0.01）×108mL-1，对照菌株的活菌数高于2株L.helveticus。张兴昌、耿铁柱等[24-25]对市售活性乳酸菌饮料的货架期稳定性进行研究时的结果也表明其活菌数均出现不同程度下降，但均在106mL-1以上，与本实验结果相近。欧盟规定，益生菌产品的活菌数在其货架期内必须至少保持在106mL-1以上[26]，本文研究的两株L.helveticus制备的活性乳酸菌饮料在贮藏期28 d内的活菌数均在108mL-1以上，且L.helveticus IMAU 30040的活菌数降低程度更为平缓且均高于菌株L.helveticus IMAU 40086，这说明IMAU 30040在活性乳酸菌饮料的应用上更具潜力。

图3 贮藏期间活性乳饮料活菌数的变化

2.3.3 贮藏期间活性乳酸菌饮料的感官评价

能否赋予产品优良的感官品质也是筛选发酵剂菌株重要的指标之一，对3组活性乳酸菌饮料在贮藏28 d内的感官品质进行评分，得分情况如图4所示。

感官品质的各项得分随着贮藏时间的延长逐渐降低，尤其是在贮藏21～28 d期间，3组乳饮料的感官各项评分均有较大程度的降低。这是由于活性乳酸菌饮料在贮藏过程中，发酵剂菌种持续发酵导致口感变酸、状态变差和出现分层现象有关。从图4可以看出，L.helveticus IMAU 30040，IMAU 40086的活性乳饮料得分均低于对照组，但3组活性乳酸菌饮料在同一贮藏时间，口感、滋味、香气、状态得分差异均不显著（P＞0.05），这表明L.helveticus IMAU 30040和IMAU 40086有应用于活性乳饮料中的潜力。

3 结论

本研究在194株传统发酵乳和制品来源的L.helveticus中筛选得到一株具有良好的生产特性和益生特性的L.helveticus IMAU 30040，该菌株具有较强的胃肠液及胆盐耐受性，发酵活性乳酸菌饮料时表现出发酵速度快、后酸化程度弱，且在贮藏期结束时仍保持108mL-1以上活菌数等优良发酵特性，感官评价得分与对照组无显著差异（P＞0.05）。因此，L.helveticus IMAU 30040具有作为活性乳酸菌饮料发酵菌种的潜力。