分散固相萃取-超高效液相色谱-三重四极杆质谱法快速检测奶粉中16种喹诺酮药物残留

李涛，周艳华，向俊,徐文泱,孙桂芳

(1.湖南省产商品质量检验研究院，食品安全监测与预警湖南省重点实验室，长沙 410111；2.长沙环境保护职业技术学院，长沙 410004)

0 引言

牛奶是一种优质蛋白质脂肪来源，而液态奶营养丰富极易腐败变质，将液态奶干燥工艺处理后得到乳粉，易于长期贮存，并营养强化了维生素矿物质，如婴幼儿配方奶粉、成人奶粉等。而随着乳制品消费量逐年增加，人们特别关注乳制品安全，奶粉的主要消费群体为儿童和老人，抵抗力弱，更需要安全无药物残留的食品。喹诺酮是一类具有4-喹诺酮结构，具有抗菌谱广、活性强、价格低等特点，广泛应用于人类和动物疾病的治疗[1-2]。为获取超额经济利益，部分养殖者为逃避监管，变换喹诺酮使用类别，兽药残留的滥用超范围使用仍然存在，从而导致动物源产品中残留药物残留，低浓度的兽药残留也会产生毒性作用，如过敏、细菌耐药，也可能对人体造成不良反应[3-5]。我国《动物性食品中兽药最高残留限量》[6]规定：牛奶中恩诺沙星残留量（与环丙沙星之和）≤100μg/kg，达氟沙星残留量≤30μg/kg，氟甲喹残留量≤50μg/kg，其他沙星类如氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星等均不得检出。

目前，喹诺酮化合物检测主要有HPLC法[7-8]、ELISA法[9]、LC-MS/MS法[10-11]等。液相色谱法对于少数几种喹诺酮类化合物具有良好灵敏度；而酶联免疫法前处理简单，适用于基层检测部门的初检筛查。液质联用法具有灵敏度高、选择好等优点，是兽药残留定量定性分析的首选方法。GB/T 20366-2006[12]和GB/T 21312-2007[13]是现行国家标准中动物源性食品中喹诺酮类的国家推荐标准。GB/T 21312-2007采用HLB固相萃取柱净化，前处理步骤繁杂，且没有牛奶中有限量要求的达氟沙星项目，而GB/T20366-2006未对牛奶基质进行验证研究，不适用于奶粉中喹诺酮药物残留检测。

试验拟分散固相萃取法对对奶粉中16种喹诺酮化合物留净化处理，超高效液相色谱串联三重四极杆质谱检测，并进行方法学验证和基质效应评价，建立了一种分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法快速检测奶粉中16种喹诺酮药物残留检验方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

奶粉，市售。

色谱纯乙腈、甲酸，上海CNW公司；16种喹诺酮混合标准溶液（恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、达氟沙星、依诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、司帕沙星、西诺沙星、氟甲喹、氟罗沙星、奥比沙星、麻保沙星）100μg/mL，天津迈迪嘉科技公司。

1.2 仪器与设备

TSQ Quantis型超高效液相色谱串联三重四极杆质谱（配有电喷雾离子源），美国Thermo Fisher公司；BSA224s型电子分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；TG16-WS型高速离心机，长沙市湘仪仪器有限公司；KQ-500DE超声波清洗器，昆山美美超声仪器有限公司；945066型数显型多管旋涡混合器，美国Talboys公司。

1.3 液相色谱条件及质谱条件优化

液相色谱条件为：A：0.1%（v/v）甲酸-5 mmol/L乙酸铵溶液，B：乙腈；流速0.25 mL/min；色谱柱温30℃；进样体积5μL，采用梯度洗脱模式。梯度洗脱程序见表1。在HESI离子源下，毛细管电压3 500 V；雾化器温度350℃，离子传输管温度350℃；鞘气压4.58 L/min；辅助气压7.97 L/min，反吹气1.5 L/min；取标准溶液直接进质谱，通过SIM和SRM扫描，确定最优质谱条件。

表1 梯度洗脱程序

1.4 样品前处理

精密称取乳粉1.0 g，加入4 mL纯水，振摇3 min后超声15 min，加入16 mL 1%甲酸乙腈，振荡15 min，离心，取4.0 mL上清液，加入分散固相萃取剂，振荡10 min后离心，上清液氮吹至近干，10%乙腈水溶液定容至1.0 m L，过0.22μm有机滤膜，供超高效液相质谱串联质谱仪测定。

1.5 方法学验证

取空白乳粉，配制2.0～100 ng/m L基质线性系列溶液，上机测定，绘制基质标准曲线。在空白乳粉添加低浓度混合标准溶液，按最优的前处理工艺处理后测定，S/N≥3的浓度为检出限（LOD），S/N≥10的浓度为定量限（LOQ）。分别在空白乳粉中加入16种喹诺酮类混合标准溶液，加标后样品浓度分别为2.0，4.0，20.0μg/kg(n=6)。测定16种喹诺酮药物残留的含量，计算回收率和相对标准偏差值。

1.6 基质效应评价

取空白乳粉，配制基质标准系列溶液，同时配制相同浓度的溶剂标准系列溶液，经液质联用仪测定后得基质标准曲线和溶剂标准曲线。依据ME=(基质标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率)×100评价16种喹诺酮化合物的基质效应[14]。

1.7 样品检测

取20批次乳粉，用所建立的检测方法检测样品中16种喹诺酮类化合物，判定样品中是否存在喹诺酮药物残留。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

通过标准物质的CAS号查询喹诺酮化合物分子量，通过SIM扫描，16种喹诺酮均在正离子模式下电离响应度最高，通过SRM扫描，得到喹诺酮质谱参数，以信号强度最高的离子为定量离子，信号强度较强的离子为定性离子，16种喹诺酮类质谱参数见表2。与高分辨质谱相比较[15]，因其特殊的检测器，高分辨质谱在质量精度和快速定性筛查具有较大优势，而三重四极杆质谱在多化合物的高通量定量检测具有较大优势，多反应离子监测，一个母离子选一个子离子，在最优碰撞电压下，母离子碰撞产生的子离子中只选一个离子，两次都选单离子，而高分辨质谱是母离子碰撞产生多个子离子，因此三重四极杆质谱噪音干扰排除的更多，灵敏度信噪比更高，稳定性也更好。在最优质谱条件下，16种喹诺酮定量离子提取色谱图见图1，由图1可知，16种喹诺酮化合物在12 min内得到了有效分离。由于喹诺酮化合物种类较多，乙酸铵溶液可改善喹诺酮峰形，分离度更好，低浓度甲酸可为喹诺酮化合物电离时提供质子，使其响应度和灵敏度更好。

图1 喹诺酮类混合标准溶液定量离子色谱图

表2 16喹诺酮类化合物的质谱参数表

2.2 净化剂优化

本研究比较了C18吸附剂、PSA吸附剂、NH2吸附剂、HLB吸附剂4种吸附剂对喹诺酮净化效果。通过前处理步骤获得含有16种喹诺酮药物残留的提取液，4 m L提取液分别加入200 mg吸附剂，振荡离心过膜后测定目标化合物，计算回收率，回收率见图2。结果表明，经C18吸附剂和PSA吸附剂净化后的回收率最高，16种喹诺酮回收率均高于70%，经HLB吸附剂处理后，氧氟沙星和达氟沙星回收率较低，经NH2吸附剂处理后，9种喹诺酮类回收率低于60%。NH2是由硅胶键合氨丙基，兼具极性吸附作用和弱阴离子交换作用，可通过弱阴离子交换（水溶液）或极性吸附（非极性有机溶液）达到保留作用。HLB吸附剂是一类用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂，对极性化合物具有较强的保留能力。PSA吸附剂是一类药物残留分析前处理中分散固相萃取的常用净化剂，PSA可与金属离子产生鳌合作用，可以有效去除脂肪酸,有机酸,和一些极性色素及糖，C18吸附剂，具有疏水作用，对非极性的组分有吸附作用，主要用于反相萃取，适合于非极性到中等极性的化合物。奶粉基质复杂，含有蛋白质、脂肪、金属离子等，为确保净化效果，本研究拟选择C18吸附剂和PSA吸附剂进行净化处理。

图2 不同吸附剂对喹诺酮回收率的影响

2.3 净化剂组合的优化

单一净化剂难以获得多药物残留较为满意的净化效果，本研究在单一吸附剂的基础上，选取了净化效果较好的C18吸附剂和PSA吸附剂，对C18吸附剂和PSA吸附剂组合的用量进行了优化。4 mL提取液分别加入吸附剂组合分别为100 mg C18+50、200 mg C18+100 mg PSA、300 mg C18+150 mg PSA，振荡离心过膜后测定目标化合物，计算回收率，回收率结果见图3。不同吸附剂用量对喹诺酮化合物回收率的也具有较大影响，当添加量为C18吸附剂用量为200 mg，PSA用量为100 mg时，各类化合物的回收率最高，当C18吸附剂用量为300 mg时，目标化合物的回收率反而降低，说明当吸附剂用量较高时，会对目标化合物产生吸附，从而降低了目标化合物的回收率，当吸附剂组合用量较低时，净化不完全及净化效果不好也会影响到目标化合物的回收率。

图3 不同吸附剂用量对喹诺酮回收率的影响

2.4 线性关系、检出限和定量限结果分析

由表3可知，16种喹诺酮浓度为2.0～100.0 ng/mL范围内，线性关系良好（R2≥0.997），检出限（LOD）范围为0.03～0.4μg/kg，定量限范围（LOQ）为0.1～1.5 μg/kg，此方法所得大部分喹诺酮化合物的检出限和定量限优于GB/T 20366-2006和GB/T 21312-2007。不同喹诺酮化合物的分子量和结构不同，在同一条件下的响应度和信噪比不同，因此检出限和定量限也不同。

表3 喹诺酮化合物的标准曲线方程、相关系数、检出限和定量限

2.5 准确度和精密度结果分析

由表4可知，当喹诺酮加标浓度为2.0μg/kg时，回收率范围为78.7%～103.9%，相对标准偏差RSD为1.4%～3.9%；当喹诺酮加标浓度为4.0μg/kg时，回收率范围为78.1%～105.3%，相对标准偏差RSD为0.9%～8.8%；当喹诺酮加标浓度为20.0μg/kg时，回收率为78.4%～100.2%，相对标准偏差RSD为1.4%～8.4%。3个浓度条件下加标回收率和精密度良好，回收率符合GB/T 27404-2008中当加标浓度＜0.1 mg/kg时，回收率范围为60%～120%。结果表明本研究所建立的方法满足奶粉中16种喹诺酮化合物的测定。

表4 喹诺酮化合物的回收率和精密度

2.6 基质效应评价

由图4可知，除依诺沙星和西诺沙星表现为基质增强效应，其他14种喹诺酮的基质效应在83.6%～119%范围内，基质效应不明显。因液相色谱-串联质谱仪的离子源结构特点，均出现基质效应，通常会对目标化合物的灵敏度、准确度和重现性等产生影响。基质效应是一种评价检验方法的有效手段。通常采用改变净化手段、增加同位素内标及基质标准曲线来降低基质效应，内标价格昂贵，且测定多种化合物需要添加多种内标，会大大提高检验成本。本研究采用分散固相萃取法净化了奶粉中的蛋白质脂肪金属元素等，并通过基质标曲降低基质效应。结果表明此研究方法中大部分喹诺酮类化合物基质效应不明显，保证检验结果准确性。

图4 16种喹诺酮化合物的基质效应

2.7 方法运用

从市场购买儿童奶粉、成人奶粉和老年奶粉、运用所建立的快速检测方法进行检测，样品中均未检出上述16种喹诺酮类化合物，且质控样品加标回收率符合GB/T 27404-2008要求，表明结果准确可靠。说明乳粉中喹诺酮化合物残留风险较小，下一步将增加样品量进行检测。

3 结论

本文建立了快速检测乳粉中16种喹诺酮类药物残留的超高效液相色谱串联质谱法。采用液液萃取法提取样品，分散固相萃取法净化样品，并对检出限、定量限、准确度等方法学指标进行了验证，采用基质效应评价了检验方法的可靠性。与相关国家标准相比，此研究验证了乳粉中喹诺酮化合物的检测方法，增加了所检测喹诺酮化合物的数量，定量限优于国家标准，采用分散固相萃取法净化样品，提高了检验效率，降低了成本，提高了检测通量，且基质效应不明显。该方法作为批量快速检测乳粉中16种喹诺酮类化合物定量检测方法，具有简单高效、灵敏度高等优点。为有效监控乳粉中喹诺酮药物残留的提供了技术支持，保证了乳制品安全。