副流感病毒5型SH蛋白单克隆抗体的制备

吴华伟，刘 丹，陈晓春，高金源，邓 永，秦义娴，苏 佳，黄小洁，薛青红，陈延飞

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

副流感病毒5型(Parainfluenza virus 5, PIV5)属于副黏病毒科腮腺炎病毒属，基因组为不分节段的单股负链RNA，全长15246 bp，由3’前导序列、5’尾随序列和7个非重叠基因组成：3’-N-P/V-M-F-SH-HN-L-5’，依次编码核衣壳蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)、V蛋白、膜基质蛋白(M)、小疏水性蛋白(SH)、血凝素-神经氨酸酶(HN)、聚合酶蛋白(L)[1]。SH蛋白作为病毒的主要包膜糖蛋白，能够抑制TNF-α介导的细胞凋亡[2-4]。2018年，中监所采用RT-PCR方法首次从某企业的猪伪狂犬病活疫苗中检测到PIV5污染[5]，随后在PIV5污染来源筛查中发现细胞和牛血清为主要的污染来源。对于兽用生物制品以及动物源性原辅材料中是否污染PIV5外源病毒的检测而言，RT-PCR方法仅可以作为初筛方法或企业内控方法，荧光抗体检查法是现行《中国兽药典》检测特定外源病毒的推荐方法。国外已有个别PIV5蛋白的单克隆抗体(如F蛋白)供应，但国内除PIV5 RT-PCR检测试剂盒外，尚无PIV5单克隆抗体或荧光抗体检测试剂供应，亟需开展PIV5 单克隆抗体研究。研究采用原核表达的PIV5 SH蛋白按常规方法免疫小鼠后，共筛选到3株杂交瘤细胞，均可识别PIV5毒株，为外源性PIV5污染检测用免疫荧光试剂奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、毒株、重组质粒、实验动物 Vero细胞、PIV5/01株，均由中国兽医药品监察所保存；pET43a-SH重组质粒，由中国兽医药品监察所构建及鉴定；8周龄Balb/c雌性小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要试剂 表达菌株BL21(DE3)plys购自北京全式金公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；Proterin Marker购自TaKaRa公司；HAT、FITC标记的山羊抗小鼠IgG为Sigma公司产品；Mouse单克隆抗体亚型鉴定试剂盒为proteintech公司产品；QuickAntibody-Mouse 3 W佐剂为北京博奥龙免疫技术有限公司产品。

1.3 重组质粒pET43a-SH的诱导表达 将重组质粒pET43a-SH 0.5 μL转化100 μL BL21(DE3)plys感受态细胞，挑菌于2 mL 相应抗性的LB培养液中37 ℃振荡培养12 h，获得种子菌。按1∶100(V/V)接种于3 mL LB培养液中，37 ℃，200 r/min 培养。培养至OD=0.6-0.8，IPTG(0.5 mmol/L)诱导，37 ℃，200 r/min培养2 h。取1 mL诱导的菌液，12000 r/min，离心1 min，弃上清，沉淀用50-100 μL 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散(加入缓冲液的量视菌体量而定)，加入与缓冲液等体积的 2 ×loading buffer，100 ℃煮5 min，电泳检测。

1.4 SH重组蛋白的可溶性分析 接1～2 μL活化的菌液到 5 ml相应抗性 LB液体培养基中，37 ℃培养，200 r/min。将培养的菌液转接到1000 mL相应抗性 LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min，培养至OD=0.6-0.8，IPTG(0.5 mmol/L)37 ℃诱导4 h。8000 r/min，离心6 min，弃上清。菌体用30 mL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，超声波破碎(500 W， 180次，每次5 s，间隔5 s)。取100 μL超声后的菌悬液，12000 r/min，离心10 min，取50 μL上清至另一EP管，上清去除干净后沉淀用50 μL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散。电泳检测。

1.5 SH重组蛋白的纯化 用去离子水洗镍柱，至pH 7.0。挂镍，至pH 2-3。用去离子水洗柱至pH 7.0。用100 mL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液平衡镍柱。用50 mL含0.5 mol/L氯化钠的10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液平衡镍柱。稀释样品，使样品中含氯化钠终浓度为0.5 mol/L，上样。上样结束后，用含0.5 mol/L氯化钠的10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液洗柱。分别用含15 mmol/L咪唑、60 mmol/L咪唑的10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)(含0.5 mol/L氯化钠)溶液洗脱，分别收集蛋白峰。SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化效果。

1.6 动物免疫 将纯化后的SH蛋白与QuickAntibody-Mouse 3 W佐剂等体积混匀，通过后腿肌肉注射免疫小鼠，每只小鼠接种100 μL。此后每隔14天按相同剂量、相同途径加强免疫，共免疫3次。融合前3日使用200 μL抗原加强免疫一次。

1.7 细胞融合 无菌条件下取免疫小鼠的脾细胞，用无血清培养基洗3次，计数并重悬于20 mL培养液中，4 ℃放置备用。取处于对数生长期的SP2/0细胞，用无血清培养基洗3次，计数并重悬，调整细胞浓度为1×107个/mL，4 ℃放置备用。将脾细胞和SP2/0细胞按5∶1混合，4 ℃离心，1000 r/min，10 min。轻轻去掉上清，并把细胞沉淀打散，置于37 ℃水浴中，在1 min内边混合边逐滴加入1 mL 50%PEG，继续混合，在2 min内加入2 mL预热的DMEM，4 min内边混合边加入另外8 mL 含10%FBS的DMEM。4 ℃离心，1000 r/min，10 min。加入含10%FBS的DMEM轻轻混匀，铺板，0.15 mL/孔，每孔1×105个细胞。加入0.05 mL HAT，37 ℃，5% CO2培养。10 d后收集杂交瘤细胞上清采用间接免疫荧光方法进行检测。

1.8 杂交瘤细胞筛选

1.8.1 荧光筛选板制备 将 PIV5/01株用病毒培养液稀释为1000 TCID50/mL，接种已长成细胞单层的96孔Vero细胞培养板，每孔100 μL, 同时设立正常细胞对照。置37 ℃培养96～120 h。然后弃去培养液，用80%冷丙酮每孔加入100 μL固定30 min，自然风干后作为荧光染色板。

1.8.2 间接免疫荧光试验程序 在PIV5/01株接毒孔和正常细胞孔中各加入50 μL细胞培养上清，置37 ℃湿盒作用45 min，用PBS液洗涤5次，每次3 min；然后加入二抗(羊抗小鼠FITC荧光抗体1∶200)，37 ℃湿盒作用45 min，用PBS液洗涤5次，每次3 min，置于倒置显微镜下观察结果，以正常细胞对照背景最暗且无特异性荧光，阳性病毒孔出现特异性荧光作为阳性杂交瘤细胞选择的依据。

1.9 杂交瘤细胞的鉴定

1.9.1 类及亚类的鉴定 使用proteintech公司的Mouse单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单抗亚类。具体步骤如下：将杂交瘤细胞上清以1 ×PBST 1∶100稀释后加入样品孔中，50 μL/孔。将1×羊抗鼠IgA+IgM+IgG-HRP加入样品孔中，50 μL/孔。混匀器上轻轻混匀，盖上封板膜，室温孵育1 h。弃去孔内液体，1×PBST洗板3次，吸水纸上拍干。将显色液A液和B液按1∶100混合后加入孔中，100 μL/孔。室温避光显色10～20 min，每孔加入终止液，100 μL/孔。结果判定：通过酶标仪读取OD450值，以OD450值最高的孔对应的亚类即为单抗亚类。

1.9.2 IFA效价测定 用PBS将杂交瘤细胞上清分别稀释为1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160后按照1.8.2间接免疫荧光方法进行检测，可观察到特异性荧光的最高稀释度即为杂交瘤细胞上清的IFA效价。

1.9.3 细胞稳定性检测 将杂交瘤细胞株体外连续培养10代，分别取第1、5、10代细胞上清及其1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀释度，按照1.8.2间接免疫荧光方法测定IFA效价。以IFA效价不低于第1代IFA效价作为细胞稳定性判定标准。

1.10 单克隆抗体腹水的制备 小鼠腹腔注射液体石蜡致敏，每只0.5 mL，7 d后经腹腔注射杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞浓度调整为2×106个细胞/mL，每只小鼠注射0.5 mL。待小鼠腹腔膨大时收取腹水，4 ℃ 12000 r/min离心10 min，收集上清液，即获得单克隆抗体。

1.11 单克隆抗体的纯化与鉴定

1.11.1 单克隆抗体的纯化 将收集的腹水以10000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清，用小型滤器过滤，置于冰上。用预冷的20 mmol/L PB、3 mol/L NaCl pH7.4溶液平衡5 mL的HiTrap MabSelect亲和纯化亲和柱10个柱体积。用预冷的20 mmol/L PB、3 mol/L NaCl pH 7.4溶液将样品稀释5倍后上柱结合。上样完毕用预冷的20 mmol/L PB 3 mol/L NaCl pH 7.4溶液平衡2.5 mL的HiTrap MabSelect亲和纯化亲和柱10个柱体积。用200 mmol/L 甘氨酸缓冲液， pH 3.0溶液洗脱，收集完毕，立即加入300 μL调节溶液，轻轻混匀即可。将收集的组分用SDS-PAGE电泳检测进行纯度检测。

1.11.2 浓度测定 采用紫外分光光度计测定纯化后的单克隆抗体浓度。

1.11.3 IFA效价测定 用PBS将纯化后的单克隆抗体稀释为1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000后按照1.8.2间接免疫荧光方法进行检测，可观察到特异性荧光的最高稀释度即为单克隆抗体的IFA效价。

1.11.4 特异性检测 将BPIV3、BVDV、IBRV、BRV、CSFV、PPV、PRV、PEDV、TGEV、PRRSV、PCV2等毒株分别稀释为1000TCID50/ml，然后接种已长成单层的敏感细胞的96孔培养培养板，同时设正常细胞对照。培养3～4日后弃去上清液，80%冷丙酮固定后，采用制备的PIV5单克隆抗体进行IFA染色，评价单抗的特异性。

2 结果与分析

2.1 pET43a-SH的诱导表达 取1 mL诱导表达的菌液进行SDS-PAGE，结果在68 ku处可见表达条带，符合预期(图1)。

M.蛋白分子质量标准；1.未诱导对照(BL21)；2-4：IPTG诱导(BL21)；5:0.5 mg/mL BSA;M.Protein molecular weight Marker;1.No induced control(BL21);2-4:IPTG induced(BL21);5. 0.5 mg/mL BSA;图1 pET43a-SH诱导表达Fig 1 The induced expression of pET43a-SH

2.2 重组蛋白的可溶性分析 超声裂解诱导后的菌液，将菌液上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，结果显示，pET43a-SH蛋白主要出现在上清中，提示该蛋白在上清中表达(图2)。

M.蛋白分子质量标准；1. 0.5 mg/mL BSA；2. 超声后全菌；3. 超声后上清；4. 超声后沉淀M.Protein molecular weight Marker;1. 0.5 mg/mL BSA; 2. Total bacteria after ultrasound; 3. Ultrasound supernatant; 3. Precipitation after ultrasound.图2 pET43a-SH重组蛋白可溶性分析Fig 2 Soluble analysis of pET43a-SH recombinant protein

2.3 蛋白纯化结果 将表达蛋白挂镍柱后用不同浓度的咪唑(15 mmol/L、60 mmol/L)洗脱，分别收集蛋白峰，进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示咪唑洗脱的最佳浓度为60 mmol/L。最终获得纯度较高的pET43a-SH重组蛋白，浓度为1.7 mg/mL(图3)。

2.4 杂交瘤细胞筛选 共筛选出3株IFA荧光阳性杂交瘤细胞株，分别命名为5B9、3G8、4E11(图4)。

2.5 杂交瘤细胞的鉴定

2.5.1 类及亚类的鉴定 采用Mouse单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对三株杂交瘤细胞进行鉴定，结果显示5B9、3G8、4E11重链类型均为IgG2a，轻链类型均为Kappa(表1)。

M.蛋白分子质量标准；1. 蛋白原样；2：流穿；3：15 mmol/L 咪唑洗脱；4-5：60 mmol/L 咪唑洗脱；6：0.5 mg/mL BSAM. Protein molecular weight Marker; 1. Original protein; 2. Flow through; 3. 15 mmol/L imidazole elution; 4-5: 60 mmol/L imidazole elution; 6. 0.5 mg/mL BSA图3 pET43a-SH重组蛋白的纯化Fig 3 Purificaiton of pET43a-SH recombinant protein

1. 杂交瘤细胞株5B9; 2. 杂交瘤细胞株3G8；3. 杂交瘤细胞株4E11；4. 正常细胞对照1. Hybridoma cell line 5B9; 2. Hybridoma cell line3G8; 3. Hybridoma cell line 4E11; 4. Normal cell control图4 杂交瘤细胞株的间接免疫荧光分析Fig 4 Indirect immunofluorescence analysis of hybridoma cell lines

表1 ELISA法测定单克隆抗体类及亚类Tab 1 Detection of subclasses of McAbs by ELISA

2.5.2 细胞上清 IFA效价测定 经测定，5B9、3G8、4E11三株杂交瘤细胞细胞上清IFA效价分别为1∶20、1∶10：1∶5。

2.5.3 细胞分泌稳定性 将杂交瘤细胞株体外连续培养10代，分别取其第1、5、10代细胞上清，5B9、3G8、4E11三株杂交瘤细胞细胞上清IFA效价分别为1∶20～1∶40、1∶10、1∶5～1∶10，稳定性较好。

2.6 腹水纯化结果 将5B9杂交瘤细胞株扩大培养后接种小鼠制备腹水。采用HiTrap MabSelect亲和纯化方法对采集的腹水进行纯化，获得纯度不低于90%的单克隆抗体(图5)。

M. 蛋白分子质量标准；1. 5B9腹水挂柱后流穿液；2. 5B9腹水挂柱后平衡液洗杂；3. 5B9腹水纯化洗脱液M. Protein molecular weight Marker; 1. 5B9 ascites was transfused after hanging the colum; 2. Cleaning of 5B9 ascites with balanced solution after hanging column; 3. 5B9 ascites purified eluent图5 5B9腹水纯化结果Fig 5 Results of 5B9 ascites purification

2.7 腹水单抗浓度测定 采用紫外分光光度计检测抗体浓度，浓度为4.256 mg/mL。

2.8 IFA效价测定 经测定，纯化后5B9单抗IFA效价可达到1∶2000(图6)。

1.5B9腹水1∶1000染色；2. 5B9腹水1∶2000染色; 3.正常细胞对照1. 5B9 ascites 1∶1000 staining; 2. 5B9 ascites 1∶2000 staining; 3. Normal cell control图6 5B9腹水的IFA效价测定Fig 6 Determination of IFA titer of 5B9 ascites

2.9 特异性检验 采用纯化后的5B9单抗进行IFA染色，除PIV5/01株阳性对照外，与BPIV3、BVDV、IBRV、BRV、CSFV、PPV、PRV、PEDV、TGEV、PRRSV、PCV2等感染的细胞孔及其正常细胞对照孔均无特异性绿色荧光出现，说明特异性良好。

3 讨论与结论

副流感病毒5型自1956年从原代猴肾细胞中首次分离[6]以来，传播迅速，目前已分布至全球。PIV5感染宿主范围较广，可感染人、犬、猫、猪、牛、虎、小熊猫、豚鼠等多种宿主[7-9]。PIV5可通过呼吸道途径在易感动物中水平传播，除犬出现明显的呼吸道症状可诱发感染犬出现“犬窝咳”外，其他动物大都呈现隐性感染，不易被发现，可成为影响兽用生物制品质量的潜在风险。牛血清、细胞(原代细胞或传代细胞)、种毒等为PIV5污染的主要来源[10]，除可采用RT-PCR方法进行快速初筛外，最终需要采用病毒分离并结合免疫荧光方法才能进行确诊。鉴于国内尚无PIV5单克隆抗体及免疫荧光抗体，开展相关试剂研制十分迫切。

目前，常用ELISA、IFA等方法作为杂交瘤细胞筛选的方法。相比较ELISA方法而言，IFA方法直接与感染病毒进行反应，能更大可能识别PIV5 SH蛋白的天然抗原表位，从而避免采用表达的蛋白可能存在的交叉反应现象，检测时间更短，结果更直观可靠。本研究利用大肠杆菌表达的纯化PIV5 SH蛋白，按常规方法免疫小鼠，采用间接免疫荧光方法筛选出3株杂交瘤细胞株，制备的腹水单抗IFA效价可达到1∶2000，与BPIV3等猪牛常见病毒均无交叉反应，为下一步开展PIV5诊断试剂(如IFA检测试剂盒)研制奠定了物质基础。