超高效液相色谱法测定原料药中加米霉素的含量

魏秀丽，冯言言，张传津*，张 琦，杨志昆，冯 涛

(1.山东省饲料兽药质量检验中心，山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，动物源细菌耐药性监测与精准化用药山东省工程实验室，济南250100；2.齐鲁动物保健品有限公司，济南250100)

加米霉素为动物专用大环内酯类抗生素，其制剂加米霉素注射液主要治疗对加米霉素敏感的溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌引起的牛呼吸道疾病，治疗对加米霉素敏感的胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌引起的猪呼吸道疾病[1-2]。加米霉素抗菌谱广[3]，抗菌活性强，药代动力学特征优良[4-5]，临床疗效好[6-8]，毒副作用小[9-10]，与同类产品替米考星相比，安全性高，无耐药性，对猪牛呼吸系统疾病的防治起到了关键作用，保障了食品安全[11-12]。在中华人民共和国农业农村部公告第16号等文献中对加米霉素及其注射液均采用普通高效液相色谱方法[13-17]检测，但检测时间比较长，所用流动相量比较大，本实验进行了原料药中加米霉素含量测定的超高效液相色谱-二极管阵列检测法(UPLC-PDA)研究。超高效液相色谱法大大缩短了检测用时。另流动相用量极大减少，减少试验耗材的用量，可极大减少对环境的污染，并降低废液处理的成本。本试验建立的超高效液相色谱法具备精准快捷、经济环保的特点，能有效控制加米霉素原料的质量，可作为企业及相关检验机构的检测方法。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂 加米霉素对照品，含量98.5%，齐鲁动物保健品有限公司提供；乙腈为色谱纯；氨水为分析纯；超纯水。加米霉素原料，来自齐鲁动物保健品有限公司产品。

1.2 仪器 Waters AcquityTMUltra performance LC超高效液相色谱仪，美国waters 公司；配Waters 2695高效液相色谱仪，美国waters 公司，配二极管阵列检测器。

1.3 方法

1.3.1 供试品溶液制备 取本品精密称定16 mg，加乙腈∶水(70∶30)溶解，并定容至20 mL。

1.3.2 标准储备液的制备 精密称取加米霉素对照品16 mg(折含量后)，加乙腈：水(70∶30)溶解，并定容至10 mL，配制成1600 μg/mL储备液。

1.3.3 标准工作液的制备 取储备液适量，配制成标准工作液：每1 mL含加米霉素1200、800、400、200、80、40、20 μg/mL的溶液。

1.3.4 色谱操作条件及参数 色谱柱：CSH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；以乙腈为流动相A，氨水(0.1∶30)为流动相B，以70∶30的比例进行等度洗脱；二极管阵列检测器，扫描范围190～400 nm，检测波长为208 nm，柱温35 ℃，进样室温度10 ℃，流速为0.45 mL/min，进样量1 μL。

1.3.5 重复性试验 精密吸取加米霉素对照品储备液，制成每1 mL含加米霉素400 μg的对照品溶液，重复配制6份，进样，计算其峰面积RSD。精密吸取上述对照品溶液，重复进样6次，计算其峰面积RSD。

1.3.6 准确度试验 取本品精密称定14.4 mg至20 mL容量瓶，加1600 μg/mL标准储备液1 mL，加乙腈∶水(70∶30)溶解，并定容至20 mL。平行做六份上机测定，按外标法以峰面积计算加米霉素的回收率和RSD。

1.3.7 检测限和定量限的测定 对加米霉素的标准工作液，进行UPLC的分析，并逐级降低其浓度，以溶液检测时的信噪比S/N≥3作为检测限、S/N≥10作为定量限。

1.3.8 不同色谱条件样品检测比较 分别使用高效液相色谱仪(参照农业农村部公告第16号文[1], 流速：1.2 mL/min；进样量：10 μL，紫外检测器)和超高效液相色谱仪(流速：0.45 mL/min；进样量：1 μL，二极管阵列检测器)在不同的色谱条件下运行，对同一样品中加米霉素的含量和出峰时间分别进行比较。

2 结果与分析

2.1 色谱分离 在优化的色谱条件下，测得加米霉素色谱峰峰形良好，且均达到基线分离，在1.3.4项条件下，加米霉素对照品和加米霉素原料样品，色谱保留时间约为4.2 min，分离度均满足要求。

2.2 线性 在选定的色谱条件下，使用等度洗脱的方法，可以有效地分离目的峰，加米霉素在80～1600 μg/ mL的范围内，线性回归方程为y=272.2x+193.23，R2=0.9996。其标准曲线见图1。

图1 加米霉素标准曲线Fig 1 Standard curve of gamithromycin

2.3 重复性试验 在选定的色谱条件下，配制400 μg/mL加米霉素对照品溶液，重复配制6份，进样，测得加米霉素峰面积RSD为0.43%；取400 μg/mL加米霉素对照品溶液，重复进样6次，测得加米霉素峰面积RSD为0.26%，均满足实验要求。

2.4 准确度实验 加米霉素的平均回收率为99.80%，RSD分别为0.32%(表1)。

2.5 检测限和定量限 40 μg/mL加米霉素对照品溶液信噪比≥3为检出限，80 μg/mL加米霉素对照品溶液信噪比≥10为定量限(图2、图3)。

表1 加米霉素添加回收实验结果(n=6)Tab 1 Experimental results of gamithromycin fortified recovery (n=6)

图2 40 μg/mL加米霉素原料色谱图UPLC 1 μLFig 2 40 μg/mLgamithromycin drug substance chromatogram UPLC 1 μL

图3 80 μg/mL加米霉素原料色谱图UPLC 1 μLFig.3 80 μg/mLgamithromycin drug substance chromatogram UPLC 1 μL

2.6 不同色谱条件样品检测结果的比较 不同色谱条件下的主成分理论塔板数、保留时间等参数的比较见表2。

表2 不同色谱条件下的主成分不同色谱参数的比较Tab 2 Comparison of principal components with different chromatographic parameters under different chromatographic conditions

由表2可见，使用waters 的CSH C18色谱柱理论塔板数非常高，性能是完全满足要求的。光谱图见图4～图5；色谱图见图6～图9。保留时间约为4.2 min，满足检测需求。

图4 加米霉素对照品UPLC光谱图Fig 4 UPLC spectrogram of gamithromycin control

图5 加米霉素对照品HPLC光谱图Fig. 5 HPLC spectrogram of gamithromycin control

图6 800 μg/mL加米霉素对照品UPLC色谱图(1 μL)Fig 6 UPLC chromatogram of 800 μg/mL gamithromycin control (1 μL)

图7 800 μg/mL加米霉素原料色谱图UPLC (1 μL)Fig.7 UPLC chromatogram of 800 μg/mL gamithromycin drug substance (1 μL)

图8 800 μg/mL加米霉素对照品HPLC 色谱图(10 μL)Fig 8 HPLC chromatogram of 800 μg/mL gamithromycin control (10 μL)

使用waters超高效液相色谱仪(色谱条件见1.3.4项)和高效液相色谱仪(色谱条件见1.3.7项)，对同一样品中加米霉素的含量(按无水物计算)分别进行了比较(表3)，无显著差异，相对偏差均小于1%，表明本实验方法简单可行，结果精确可靠。

图9 800 μg/mL加米霉素原料HPLC色谱图(10 μL)Fig.9 HPLC chromatogram of 800 μg/mL gamithromycin raw material (10 μL)

表3 不同色谱条件下加米霉素含量检测结果表(n=4)Tab 3 Results of different chromatographic conditions for the content of gamithromycin (n=4)

由于两种色谱方法均已通过其方法学验证，均可以准确控制其指标成分。从检测效率上看，优选超高效法(UPLC)。

3 讨论与结论

3.1 UPLC方法波长的选择及定性鉴别 本研究将加米霉素的对照溶液利用PDA检测器采集其光谱图，在波长190～400 nm范围内进行扫描，加米霉素在198.2 nm左右有最大吸收，根据光谱图可以判断含有主成分，可以作为定性鉴别的手段；198.2 nm信号噪音较大，最终选择同原农业农村部公告中208 nm作为检测波长，35 ℃柱温，保留时间约为4.2 min。

3.2 UPLC方法色谱柱耐用性实验 改变流速0.44、0.46 mL/min，柱温35 ℃不变，保留时间上下浮动0.3 min以内。改变柱温33、37、40 ℃，流速0.45 mL/min不变，保留时间上下浮动0.3 min以内，均能达到良好的分离度和精确的含量测定结果。色谱柱性能稳定，适合本项目加米霉素含量的测定。

3.3 本方法与农业农村部颁布的质量标准[13]的结果对比 本实验选择了兽药企业的加米霉素原料进行含量测定，分别采用高效液相色谱方法和超高效液相色谱方法，原料中加米霉素含量相对偏差均小于1%。超高效液相流动相的流速为0.45 mL/min，需要运行10 min，每针运行需要4.5 mL流动相；高效液相色谱仪器流速为1.2 mL/min，运行时间40 min，每针运行需要48 mL流动相。超高效液相色谱更节约实验耗材溶剂等，每运行一针流动相节省43.5 mL，并节约了30 min时间。在废液处理高成本的今天，超高效液相色谱方法更有优势，更经济和快捷。

本实验建立的超高效液相色谱法，对加米霉素原料中加米霉素进行定性和定量测定，方法快速，可以作为企业内控标准方法，具备精准快捷、经济环保的特点，能有效控制加米霉素原料的质量。