促进自体冻存卵巢组织移植存活的方法研究进展

屈凌寒 余州 宋保强

癌症治疗技术的发展改善了癌症患者的预后。自1991年以来，癌症患者的病死率下降了29%，女性癌症患者的5年生存率超过64%[1]。然而，化学药物治疗（化疗）和放射治疗（放疗）的不良反应可能导致卵巢早衰和不孕。因此，如何保存接受放、化疗女性患者的卵巢组织活力和维持卵泡的受精能力已成为生殖领域的研究热点。随着卵巢冻存技术的发展，自体冻存卵巢组织移植已经成为解决这一问题的最佳方案。但移植卵巢组织的活力仍较为有限，探索更加有效的能够促进自体冻存卵巢组织移植存活的方法具有重要意义，本文就自体冻存卵巢组织移植的研究进展作一综述。

1 人类自体冻存卵巢组织移植研究的起源和发展

Donnez等[2]于2004年10月报道了人类第1例自体冻存卵巢组织移植后成功活产的案例。该女性患者为霍奇金淋巴瘤Ⅳ期，在化疗开始前进行卵巢皮质冻存，在淋巴瘤治疗之后，患者出现卵巢早衰。2003年该患者进行了腹腔镜下自体冻存卵巢组织原位移植，11个月后，患者自然受孕，超声检查显示宫内妊娠，最终诞下1名健康女婴。自体冻存卵巢组织移植已从实验阶段发展到了临床应用阶段，造福了许多年轻的癌症患者。放疗和化疗可能造成卵巢早衰，因此越来越多的癌症患者选择在放、化疗前进行卵巢组织冻存，放、化疗结束之后再进行自体冻存卵巢组织移植。临床研究表明，自体冻存卵巢组织移植的效果与新鲜卵巢组织移植接近[3]，且没有排斥反应，这进一步推动了自体冻存卵巢组织移植技术的发展和应用。迄今为止，此类手术在全球范围内已经进行了数百例，妊娠率为30%～50%，活产超过130例[4]。自体冻存卵巢组织移植后出生的新生儿出生缺陷或其他异常情况的发生率与常规新生儿相比，差异无统计学意义[5]，表明自体冻存卵巢组织移植是保存女性生育能力的有效手段。

2 影响自体冻存卵巢组织移植存活的因素

虽然在自体冻存卵巢组织移植受者中，术后95%的受者卵巢功能恢复，但移植物存活的时间不尽相同。部分受者的卵巢功能可以维持数年，而有的在术后几个月内就丧失功能。研究表明，移植物中的卵泡数量受多种因素影响，包括受者年龄，自然变异，移植前接受放、化疗情况以及移植物大小等，且绝大多数原始卵泡会在卵巢组织冻存和移植过程中丢失[5]。而最终决定移植物寿命的是移植卵巢组织中存活下来的原始卵泡的数量。因此，如何最大限度地保证移植物中卵泡存活一直是人们研究的重点。

2.1 冷冻方法和冷冻保护剂

玻璃化冷冻和程序化慢速冷冻是卵巢冻存的常用方法，其中程序化慢速冷冻使用更广泛[6]。目前报道的自体冻存卵巢组织移植后活产病例，绝大部分采用的是程序化慢速冷冻法，仅2例是玻璃化冷冻[7]。程序化慢速冷冻采用低浓度冷冻保护剂，可降低细胞毒性，但冷冻过程容易产生冰晶，造成细胞损伤，且步骤繁琐、耗时较长、所需设备昂贵。玻璃化冷冻是一种快速降温的方法，使细胞内外液态直接转变为非晶体的玻璃化态，此过程可减少细胞内外冰晶形成，且不需要使用特殊的设备，节省时间和成本，但需要使用高浓度的冷冻保护剂，对细胞的毒性较大。有研究发现，与程序化慢速冷冻法相比，玻璃化冷冻的健康卵泡与原始卵泡的密度之比较高，原始卵泡的DNA链断裂减少，能更好地保存基质细胞，有效地保存卵巢组织和改善移植卵巢组织的功能[8]。由于卵泡存活率高且受损卵泡较少，玻璃化冷冻被认为是冻存卵巢组织最有效的方法。但由于目前临床数据较少，玻璃化冷冻的临床意义尚无法估计，还需要开展更多临床研究确定其安全性和有效性。

冷冻保护剂的选择也是决定低温保存成功与否的重要因素。研究发现使用乙二醇、丙二醇或二甲基亚砜冻存和解冻的生殖细胞存活率高，组织形态完整，细胞结构和形态良好，而甘油的保存效果较差[9]。二甲基亚砜是目前国际上最常用和最成熟的卵巢组织冷冻保护剂。

2.2 移植部位

卵巢组织一般是通过腹腔镜手术进行原位移植，移植部位包括卵巢、卵巢窝和阔韧带。与异位移植相比，原位移植可维持自然妊娠的能力。全球报道的大多数活产病例均来自原位移植的卵巢组织[10]。von Wol ff等[11]提出了卵巢旁腹膜、卵巢内和卵巢上3个原位移植部位，其中卵巢上移植需要专业的腹腔镜显微外科技术才能在1～2 h内完成手术。

据报道，异位移植会产生大量空卵泡，卵泡发育受阻，卵母细胞回收率低，受精率低，可能受环境温度、局部压力、旁分泌因子和血液供应等因素的影响[12]。截止至2019年的文献报道，仅有2例异位移植后活产，1例移植到腹壁，另1例移植到骨盆[6]。且异位移植后期还需回收卵子进行体外受精和胚胎移植，过程比较繁琐，成本更高。有动物实验比较了原位移植和不同部位异位移植的效果，包括肌肉、脂肪垫、肾包膜和皮下组织，其结果一致表明，原位移植可保留较高比例的原始卵泡，成功率更高[13]，与其他研究中心的临床结果相一致[14-15]。

2.3 移植物大小

移植物大小会影响卵泡丢失情况。冷冻前将卵巢皮质块切割为薄的条块，可以使低温保护剂更好地渗透和排出，减少冰晶形成和细胞损伤，并为新生血管提供较短的穿过距离，缩短缺血期。通常，卵巢皮质被制备成1～2 mm厚的条块状组织进行移植。然而，就氧气扩散而言，扩散距离>0.2 mm就会受限，而生长因子和营养素等较大分子的扩散距离则更短。因此，人们推测减少移植物的大小和厚度可以促进移植物的血管形成，减少缺血和缺氧。有研究者尝试制造更薄的移植物“微器官”，以进一步缩短营养物质和氧气扩散距离。然而，一项异种移植研究比较了移植卵巢大小对移植卵巢血管形成的影响，发现减小移植卵巢不仅不会促进移植卵巢的血运重建，还会增加卵泡激活，导致休眠卵泡的损失增加，可能原因是组织的切割破坏了Hippo通路，触发了卵泡的生长[16]。

有研究者探索了带血管吻合的冻存全卵巢移植，结果发现这种方法可以立即重建卵巢皮质血运，并降低缺血性损伤的发生率[17]。但冻存一个大且完整的卵巢较为困难，因为冷冻保护剂很难充分扩散到大的组织块，且血管内冰晶的形成易造成血管损伤。但在动物实验中，也有自体冻存全卵巢移植的报道。Campbell等[18]采用优化的冻存技术和术后抗凝治疗方法对成年绵羊进行了自体冻存全卵巢移植，术后卵巢功能完全恢复，自然受孕率高且多胎活产。Martinez-Madrid等[17]将完整的带血管蒂的人类卵巢在冷冻容器内的低温保护液中进行缓慢冷冻，解冻后卵泡和小血管的存活率为75%。虽然绵羊自体冻存全卵巢移植后能产下健康的后代，但人类自体冻存全卵巢移植至今尚未出现活产。改善冷冻条件、优化冷冻保护剂及提高微血管吻合技术可能使自体冻存全卵巢移植成为保存生育能力的一种手段。

3 促进自体冻存卵巢组织移植存活的方法

3.1 生长因子

自体冻存卵巢组织移植后，血运重建延迟引起的缺氧是导致卵泡过早衰竭的主要原因。卵巢皮质片的移植没有血管吻合，因此移植物的存活取决于血运重建。卵巢组织移植后的血运重建在啮齿类动物中需要48 h，在人类中长达5 d[6]。多种生长因子可以促进移植卵巢组织新生血管的形成，目前研究比较多的包括碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）等。

3.1.1 碱性成纤维细胞生长因子 bFGF能促进血管生成和卵泡存活。将bFGF混合到小鼠和人类的自体冻存卵巢组织进行移植，可以显著增加卵巢组织CD31阳性区域，并促进基质细胞和血管内皮细胞的增殖，降低移植卵巢组织的纤维化，使原始卵泡和初级卵泡密度显著增加[19]。

3.1.2 血管内皮生长因子 VEGF可促进移植卵巢组织的血管生成。自体冻存卵巢组织移植后，移植物的缺氧微环境会引起VEGF表达上调。但在灵长类动物的移植卵巢组织内注射VEGF或外源性促性腺激素后，不能有效改善移植卵巢组织的功能和卵泡存活率。但也有研究发现，从生物材料中控制释放的VEGF可有效促进血管生成。由于移植部位和移植物之间缺乏物理连接，限制了细胞浸润和旁分泌通讯，研究人员用含有纤维蛋白-肝素结合肽（heparin-binding peptide，HBP）-VEGF的水凝胶包埋自体冻存卵巢组织进行移植，并进行卵泡计数和血管密度测量，结果发现VEGF可以促进血管生成和原始卵泡存活[20]。

3.1.3 促红细胞生成素 EPO可促进红系祖细胞的分化和增殖，并防止细胞凋亡，提高移植组织的存活率。Suzuki等[21]将冻存的犬卵巢组织与EPO或去唾液酸EPO移植到免疫缺陷小鼠的卵巢囊，4周后取出卵巢进行组织学检查，发现早期初级卵泡的存活率存在较大差异，EPO组为15.2%，去唾液酸EPO组为157.6%，而未治疗组则仅为10.1%。表明使用去唾液酸EPO可以有效地提高冻存卵巢组织的卵泡存活率。且去唾液酸EPO组移植物中的初级卵泡数量增多，表明去唾液酸EPO可促进原始卵泡生长。目前尚不清楚去唾液酸EPO如何促进卵泡细胞的分化和增殖。但已有研究表明，女性生殖器官或组织（包括卵泡）在不同时期均表达EPO受体，EPO的信号转导参与了女性生殖器官的周期性变化，且去唾液酸EPO可有效预防冻存卵巢组织移植后卵泡丢失。

3.2 激 素

在自体冻存卵巢组织移植过程中，某些激素也可以发挥很好的保护作用。目前研究较多的是促性腺激素、雄激素和抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）。

3.2.1 促性腺激素 在移植前用卵泡刺激素（folliclestimulating hormone，FSH）培养卵巢组织，可增加移植后卵巢组织VEGF和bFGF的表达及血管密度[22]，其最佳使用条件为：用0.30 IU/mL的FSH干预自体冻存卵巢组织6 h，可加速移植卵巢组织的血运重建，且不会对卵巢产生过度刺激。用含有人绝经期促性腺激素（human menopausal gonadotropin，HMG）的培养基培养小鼠卵巢组织并将其移植到小鼠肾包膜，结果显示卵巢组织移植后VEGF表达增强，卵泡存活率提高[22]。黄体生成素（luteinizing hormone，LH）在自体冻存卵巢组织移植中也可促进正常卵泡的生成，并上调玻璃化冻存卵巢组织中VEGF、连接素Cx37和Cx43的表达，促进卵巢组织的存活，并维持其功能，缩短小鼠的发情周期，且妊娠率和第一胎产仔数均正常[23]。然而促性腺激素在促进移植卵巢组织中卵母细胞发育和成熟的同时，也会造成原始卵泡的丢失，缩短移植物的存活时间[22]。

3.2.2 雄激素 研究表明，雄性小鼠的激素环境可以支持移植卵巢中卵母细胞生长，并产生活的后代，因而雄激素也被认为是改善自体冻存卵巢组织移植存活的因素[20]。在异种移植模型中，将人类卵巢组织异种移植到雄性小鼠体内，可以观察到形态正常的卵泡，在HMG刺激后，会产生更多的窦前卵泡和窦卵泡[24]。此外，将人类和小鼠的卵巢组织异种移植到雄性啮齿类动物，可以产生比雌性受体更多的卵母细胞，表明雄性受体可能是提高移植卵巢组织中卵母细胞产量的较好模型[24]。后续研究发现，在雄性受体中生长的小鼠卵母细胞可以受精，并发育成活幼仔，说明雄性小鼠的激素环境可以支持同种异体移植卵巢组织中卵母细胞的生长[25]。而雄激素在人类自体冻存卵巢组织移植中的作用，还有待进一步的研究。

3.2.3 抗苗勒管激素 AMH是转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β超家族的成员之一，也可改善自体冻存卵巢组织移植存活。AMH具有抑制卵泡激活的作用，而卵泡激活是移植卵巢中原始卵泡耗竭的重要原因[26-27]。研究发现，AMH在生长卵泡中高表达，AMH基因敲除小鼠的卵巢卵泡活动增强，原始卵泡储备加速消耗，表明AMH可以抑制原始卵泡的激活[28]。而后续的绵羊模型研究发现，AMH不影响原始卵泡的动员，但可调节早期卵泡发育的速度[29]。AMH可能在卵泡发育过程中发挥多种作用，单排卵和多排卵物种之间AMH的功能可能存在差异，但抑制卵泡活动和减缓早期卵泡生长速度，可能会提高自体冻存卵巢组织移植后的卵泡产量。在实际应用中，将AMH与细胞治疗联合用于卵巢组织移植，既能增加血管生成，又能减少卵泡激活，这种联合方案显示了良好的卵泡储备保护功能[30]。

3.3 抗凋亡药物

卵巢玻璃化冷冻和移植过程中原始卵泡丢失的机制尚不完全清楚。有研究表明，卵泡的死亡和丢失可能主要是由细胞凋亡引起[20]。因此，抗凋亡药物如Kit配体、鞘氨醇-1-磷酸（sphingominol 1 phosphate,S1P）等被用于保护卵泡的存活，但抗凋亡药物的作用有限，仅能减少部分卵泡的损失。Yang等[31]认为凋亡不是唯一的途径，自噬（Ⅱ型程序性细胞死亡）在卵巢玻璃化冷冻和移植中也具有重要作用。另有研究表明，小鼠自体冻存卵巢组织移植过程中存在焦亡，抑制焦亡可提高移植物中原始卵泡、窦状卵泡的密度以及雌二醇浓度，因此抑制焦亡可能会降低卵泡的激活和衰竭，从而改善移植卵巢组织的功能[32]。卵巢玻璃化冷冻和移植过程中原始卵泡丢失可能是多种机制共同作用的结果，但目前研究较多的仍是细胞凋亡。

3.3.1 Kit配体 Kit配体由颗粒细胞分泌，也称为干细胞因子、Steel因子或肥大细胞生长因子，参与原始卵泡的激活、卵母细胞的生长以及颗粒细胞和卵泡膜细胞的增殖。其受体位于小鼠、大鼠和人类产后卵母细胞和卵泡膜细胞表面，并刺激原始卵泡激活。Kit配体也可以作为一种生存因子，有效地促进卵泡的存活，减少细胞凋亡。Jin等[33]发现，使用Kit配体处理大鼠卵巢可显著减少凋亡卵母细胞的数量。这种抗凋亡作用可能是通过磷酸酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）途径介导的，它抑制了Fas介导的细胞凋亡。Liu等[34]证明Kit配体可下调新生大鼠卵巢原始卵泡和卵母细胞中p27 KIP1和促凋亡因子（如Bim、Bad和Bax）的表达，表明Kit配体对促进卵泡细胞存活和减少窦前卵泡凋亡至关重要[35]。

3.3.2 鞘氨醇-1-磷酸 S1P是G蛋白偶联受体家族的配体，是一种凋亡抑制因子。早期研究证明，S1P可抑制化疗和放疗引起的细胞凋亡[36]。研究人员发现，在人类卵巢组织异种移植模型中，S1P可增加血管密度，加速血管生成并可促使卵巢间质细胞显著增殖，减少组织缺氧和坏死，降低卵泡的凋亡率[37]。在玻璃化冷冻卵巢组织的过程中，将S1P加入到玻璃化冷冻液中可防止原始卵泡池的凋亡。

3.4 缺血-再灌注损伤中的保护

冻存卵巢组织移植中无血管吻合，因而血运重建的时间会对移植物中卵泡的存活和功能产生重要影响。移植物在新生血管形成后会发生缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI），在移植后的最初3日表现最为明显，IRI过程会产生大量活性氧物质，导致细胞损伤和线粒体功能下降，造成大多数原始卵泡死亡，Caspase-1是介导这一过程的酶[38]。近年来研究人员发现，优化的冷冻保护剂灌注比浸泡在冷冻保护剂中冷冻保存全卵巢更有效[39]；冷藏后低温机械灌注对卵巢运输过程中的短期保存效果优于单纯冷藏[40]。低温机械灌注可清除微血栓和代谢产物，改善内皮细胞和实质细胞的微环境，防止三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的耗竭和线粒体水肿[33]。

此外，内源性抗氧化因子可中和缺血应激期间产生过量的氧自由基，外源性抗氧化剂，如维生素E、褪黑素等可能有助于提高卵巢组织移植后卵泡存活率。但抗氧化剂对卵巢组织移植的作用有限，且存在很大争议[20]。研究发现，维拉帕米可有效保存卵泡池，减轻小鼠卵巢组织移植引起的IRI，但其作用机制尚不清楚[41]。

3.5 细胞联合移植

与干细胞或其他类型细胞的联合移植也是改善自体冻存卵巢组织移植存活的新途径，尤其是间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）、脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cell，ADSC）和外源性内皮细胞。

3.5.1 间充质干细胞 MSC可分化为内皮细胞和周细胞，从而提供稳定新生血管所必需的细胞成分。在异种移植模型中已经观察到，与MSC联合移植可促进卵巢组织的血管生成[20]。MSC在低温卵巢组织中可以提高VEGF和bFGF的表达水平，尤其是血管生成素的表达水平，显著刺激新生血管形成，增加移植物的血液灌注[20]。研究表明，MSC可通过分泌胰岛素样生长因子1、白细胞介素（interleukin，IL）-6、VEGF-A、肝细胞生长因子和TGF-β，并抑制肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和Bcl-2等炎症因子的表达来发挥抗凋亡作用，降低移植卵巢组织中原始卵泡的凋亡率，减少卵泡损失[42]。

3.5.2 脂肪来源干细胞 由于ADSC具有刺激血管生长的能力，被认为是缺血性疾病细胞治疗的有效方案。ADSC可产生多种促血管生成因子和抗凋亡因子，且缺氧处理的ADSC在体内可以促进血管生成和新生血管的成熟[43]。有研究表明，卵巢组织联合ADSC移植可以促进术后早期血管形成（高氧分压和CD34表达），提高卵泡存活率，减少细胞凋亡[44-46]。

3.5.3 外源性内皮细胞 外源性内皮细胞联合移植对人类卵巢组织的卵泡存活和功能恢复具有重要作用。由于卵巢组织移植没有进行血管吻合，容易导致缺血损伤和移植物内卵泡过早激活。而外源性内皮细胞能够在移植部位和移植物间形成功能性灌注血管，提高移植物中卵泡存活率和卵泡体积，并促进窦性卵泡发育。且重组表达AMH的外源性内皮细胞可抑制原始卵泡的激活，促进其功能保存[28]，还可加快组织的血运重建，并可挽救卵巢移植物中的大量卵泡[24]。

4 结 语

自体冻存卵巢组织移植作为一种保存生育能力的技术，造福了越来越多的年轻癌症患者，世界各地以这种方式出生的婴儿逐年增多。如何促进自体卵巢组织移植存活仍是目前的研究热点。改进卵巢冻存液配方、优化冻存和复苏流程以及联合移植可能成为未来的发展方向。因此需要世界各国专家的共同努力，建立一套自体冻存卵巢组织移植标准方案，推动基于自体冻存卵巢组织移植的辅助生殖技术的进步。