延迟采收对豫中烤烟上部叶生理指标和代谢组学的影响

彭翠云 汪海燕 史宏志 郭 慧 杨惠娟,*

(1 河南农业大学烟草学院，河南 郑州 450002；2 浙江大学农业与生物技术学院核农所，浙江 杭州 310000)

烟草(Nicotiana)，在我国种植历史悠久，随着经济不断发展，我国烟草需求量急剧增加。烤烟上部叶是卷烟配方中的重要组成部分[1-2]，我国上部烟叶在工业使用过程中普遍存在内在化学成分不协调、组织结构紧凑、颜色偏深、烟碱量过高、糖碱比过低等情况，限制了上部叶的使用率[3]。为解决“豫浓香”高端原料供应不足的问题，提高豫中烟区上部叶采收质量十分必要。研究表明，在烟叶采收方法上，烟株上部叶片充分成熟后一次性采收可以提高烟叶成熟度[4-5]。此外，在一次性采收的基础上推迟采收时间也可以提高烟叶成熟度，改善烟叶理化特性及协调性[6-7]。田阿林等[8]从安仁烟区上部烟叶的外观质量和主要化学成分指标两个方面考虑，分析得出推迟采收可使上部叶质量达到最佳；张冰濯等[9]研究发现湖南烟区上六片烟叶在常规采收基础上延迟7 d，可以提高烟叶成熟度。

烟叶在成熟过程中生理生化特性变化复杂多样，其中碳氮代谢是烟叶成熟过程中最基本的生理代谢过程[10]。潘飞龙等[11]发现碳代谢中淀粉及还原糖含量随着烟叶成熟度增加逐渐上升，直至烟叶工艺成熟期，随后含量开始下降。抗氧化酶活性是反映烟叶衰老程度的重要指标，孙光伟等[12]发现在烟叶采收过程中，延缓采收上部叶会造成上部叶中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量增加，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)等抗氧化酶活性降低，加剧叶片氧化衰老。董洪旭等[13]研究发现过熟采收的烟叶脯氨酸(proline，Pro)比例较高，欠熟采收的烟叶Pro比例较低；张光利等[14]发现烟叶在未熟至过熟的过程中，Pro含量呈倒“V”形曲线变化，Pro含量可作为判断烟叶田间成熟度的生化指标。

烟叶中化学成分含量与烤后烟烟叶的外观质量、致香成分质量、评吸质量等密切相关[15]，代谢产物是烟草化学成分表达的终产物。代谢组学不仅可以了解烟叶代谢产物的时空积累模式，还可以研究其成分和含量在不同外界环境条件下的变化情况，其种类和数量变化是生物系统对基因或环境变化的最终响应[16-17]。目前，代谢组学技术在烟草上的应用大多集中于土壤、海拔、日照、降雨等生长环境因素对代谢的影响[18]。2011年Li等[19]创立了一种基于液相色谱质谱/质谱联用(liquid chromatograph mass spectrometer/mass spectrometer，LC-MS/MS)技术针对烟叶代谢谱分析的方法，应用此方法对津巴布韦和中国两地烟叶中的代谢物进行了比较,并分析出两地区之间主要的差异代谢物。

本研究通过延迟上部叶采收时间，分析推迟不同天数采收时上部叶中相关酶活性以及代谢组学的变化，并研究延迟采收对烟叶质量的影响，进一步确定烟叶的适宜采收时间，以期为科学指导田间采收提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烤烟品种为中烟100，该品种是许昌烤烟烟区的主栽品种。试验于2018年在河南省许昌市襄城县王洛镇科技试验基地开展，该地位于113°03′～114°19′E，33°42′～34°24′N，属北暖温带季风气候区，热量资源丰富，雨量充沛，阳光充足，无霜期长，年平均气温在14.3℃～14.6℃之间，最热月在7月，平均气温为27.2℃～27.4℃。

1.2 试验设计

试验选择地势平坦，排水条件良好的地块，行株距为1.20 m×0.55 m，于2018年4月27日移栽，6月30日打顶，每株留叶数为18～22片，按照当地优质烟生产方式，统一进行施肥和中耕管理。

试验设置5个处理，每处理3次重复，小区面积333 m2。从当地常规采收时间9月1日开始，每隔4 d采收一次，采集样品为每个处理的上部叶，共取样5次，分别为：9月1日常规采收(CK)、延迟4 d采收(T1)、延迟8 d采收(T2)、延迟12 d采收(T3)、延迟16 d采收(T4)。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 烤烟叶片基本化学、生理指标测定 选取鲜烟叶中间部分注意避开主脉和支脉(面积约为2 cm×3 cm)， 取样设置3次重复。将取得样品迅速清洗干净后放入液氮速冻，随后放入-80℃超低温冰箱中保存。SOD活性测定采用氮兰四唑(NBT)光还原法[20]测定；POD活性测定采用愈创木酚还原法[21]测定；CAT活性测定采用紫外分光吸收法[22]测定；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥比色法[23]测定。Pro含量测定先用磺基水杨酸提取，然后在加热处理下与酸性茚三酮溶液反应，再经甲苯萃取后，采用酶标仪在520 nm波长处测定吸光度值，用以计算Pro含量[24]；还原糖含量、硝酸还原酶(nitrate reductase，NR)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthelase，GS)活性测定采用微量试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)测定。

1.3.2 代谢组学测定及分析 采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间液质联用技术(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight liquid chromatograph mass spectrometer，UPLC-Q-TOFLC-MS)对烟草不同处理模式5组样品进行代谢物鉴定，每组样品5个时间点，分别为常规采收(CK)、延迟4 d、延迟8 d、延迟12 d、延迟16 d。通过UPLC-Q-TOFLC-MS技术获取指纹图谱后，采用Analyst TF 1.7 Software导出原始数据，通过Peak View去掉异常峰；通过Mark View进行峰对齐。最终获得包含质荷比、保留时间和峰面积的三维数据表，利用QC样品对所有峰进行校正，将校正后的数据导入SimcaP v13.0和EZinfo 3.0进行多维统计分析，以便筛选出变量。

1.4 数据分析

采用Excel 2016对数据结果进行统计，采用SPSS 25.0对统计的数据采用T检验进行显著性分析，之后运用GraphPad Prism 8、Origin 2019等软件对数据结果进行绘图。

2 结果与分析

2.1 延迟采收对抗氧化酶活性及MDA含量的影响

由图1可知，随着采收期的延迟及烟叶成熟的增加，烟叶中SOD活性均有不同程度的降低，其中延迟采收4、8、12、16 d(T1、T2、T3、T4)分别较常规采收期(CK)降低13.46%、19.03%、56.48%、57.45%；POD和CAT活性随着采收延迟的变化与SOD一致，均呈逐渐下降趋势，其中延迟16 d采收处理的POD活性最低，与CK相比显著降低72.56%。MDA含量是反映细胞组织衰老程度的重要指标，随着采收期的延迟，MDA含量逐渐升高，延迟采收16 d时含量达到最高，较CK显著升高373.68%。随着采收期的延迟，Pro含量逐渐增加，与CK相比，延迟采收4、8、12 d烤烟叶片的Pro含量分别升高了105.21%、159.91%、255.52%，延迟采收16 d的Pro含量达到最高，说明此时植物抗逆性减弱，叶片成熟度增加。

注：图中不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。Note:Different lowercase letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level. The same as following.图1 上部叶延迟采收期过程中抗氧化酶活性及MDA含量的变化趋势Fig.1 Change trend of antioxidant enzyme activities and MDA content in upper leaves during delayed harvest period

2.2 延迟采收对还原糖含量的影响

由图2可知，上部叶中还原糖含量随采收期推迟呈先上升后下降的趋势，延迟8 d采收时还原糖含量达到最高，较CK提高97.10%；延迟4 d采收时烟叶中还原糖含量较CK呈显著上升趋势，较CK提高12.42%；延迟12 d采收时烟叶中还原糖含量开始下降；延迟16 d采收时烟叶中还原糖含量最低，较延迟8 d采收显著降低63.12%。

图2 上部叶延迟采收期过程中可还原糖含量的变化趋势Fig.2 Change trend of reducing sugar contentin the upper flue-cured tobacco leaves during delayed harvest period

2.3 延迟采收对上部叶氮代谢关键酶活性的影响

延迟采收的情况下，烟叶中NR和GS活性变化趋势如图3所示。随着采收期推迟，NR和GS活性逐渐减弱，延迟4、8、12、16 d采收的烤烟NR活性分别较CK显著降低33.12%、53.74%、73.47%、74.01%。GS活性变化趋势与NR相似，延迟16 d采收时酶活性达到最低，较CK显著降低65.62%，延迟4、8和12 d采收时酶活性分别较CK显著降低22.45%、50.79%、59.72%。

图3 上部叶延迟采收过程中氮代谢关键酶活性的变化趋势Fig.3 Changes in activities of key enzymes in nitrogen metabolism during delayed harvesting of the upper flue-cured tobacco leaves

2.4 延迟采收下上部叶代谢组学分析

2.4.1 代谢组学数据质量控制与评估 为了消除检测仪器稳定度与灵敏度、个体差异性以及噪声等因素对分析结果造成的影响，采用Pareto-scaling法对代谢组学数据进行归一化处理，将代谢组学数据分为正负离子模式进行分析归一化后，数据内部结构发生变化，正负离子模式下的数据具有可比性，且经过归一化分析可将不同数量级的变量转换至合适范围。经过主成分分析(principal component analysis，PCA)和偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA)，发现正模式下数据分组分离趋势明显，负模式下分组不明显，正模式下的代谢物有进一步分析的意义。

2.4.2 不同采收期的下烟叶中代谢物STEM时间序列分析 用Cluster软件对各采收时间处理上部叶中的差异代谢物进行时间序列分析(short time-series expression miner, STEM)分析，对5个处理的代谢物进行分类，结果如图4所示。CK经过STEM分析得到两组显著类型(P<0.01)，其中一组呈先下调再上调趋势，共35种代谢物；另一组呈持续下调模式，共35种代谢物。延迟4 d采收处理经过STEM分析得到两组显著类型(P<0.01)，其中一组持续下调，另一组先下调再上调；延迟8 d采收处理经过STEM分析得到一组显著类型(P<0.01)，表现为持续下调，代谢物表达趋势图显示共有41种代谢物；延迟12 d采收处理经过STEM分析只得到一组持续下调的显著类型(P<0.01)，共有38种代谢物；延迟16 d采收处理经过STEM分析得到两组显著类型(P<0.01)，一组持续下调，一组为先下调再上调，代谢物表达趋势显示持续下调的一组共有34种代谢物，先下调再上调的一组共有32种代谢物。

图4 不同采收期的上部叶代谢物STEM分析Fig.4 STEM analysis of metabolites in lower and upper leaves at different harvesting stages

2.4.3 不同采收期的代谢途径(kyoto encyclopedia of gens and genomes, KEGG)富集分析 延迟采收情况下，上部叶中差异代谢物共富集在296条代谢通路上，其中显著富集(P<0.05)的代谢通路共有69条，其中CK的上部叶中显著代谢通路有11条，延迟4、8、12、16 d采收时上部叶中显著富集的代谢通路分别有20、13、10和15条。不同采收期下差异代谢物KEGG富集分析结果如表1所示。

由表1可知，不同采收期中相同的代谢物主要富集在托品烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成、莽草酸途径、不饱和脂肪酸的生物合成、萜类化合物和类固醇的生物合成等8条代谢通路中。其中托品烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代谢4条代谢通路在延迟采收过程中始终呈下调表达。富集在莽草酸途径、植物激素的生物合成、萜类化合物和类固醇的生物合成、淀粉和蔗糖代谢4条代谢通路上的代谢物在延迟8 d后呈下调表达，在延迟8 d之内时呈先下调再上调的表达。

3 讨论

通过对不同采收期处理下的上部位烟叶生理指标和代谢组学变化的分析发现，随着采收期的延迟，萜类化合物和类固醇的生物合成途径、苯丙素生物合成(莽草酸途径)中的差异代谢物富集表达量呈显著下调，其中萜类化合物是植物次生代谢产物中最多的一类，萜类化合物在植物应对逆境胁迫中发挥防御功能，萜类化合物合成途径中代谢物表达量下调说明随着采收期延迟，烟叶内部抗逆性机制代谢减弱，因此造成烟叶抗氧化系统中SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性下降，抗氧化酶活性下降会造成细胞中活性氧数量以及MDA含量上升，导致细胞膜过氧化程度增加，细胞组织衰老程度加剧，这与何聪莲等[25]的研究结果一致，同时与前人在小麦[26]、甜瓜[27]等作物中的研究结果相似。苯丙素生物合成中的阿魏酰-5-羟基化酶、咖啡酸3-O-甲基转移酶是木质素生物合成途径的关键酶[28-29]，而木质素在植物抵御外界胁迫过程具有重要作用，能够提高叶内水分迁移有效效率，协调烟叶内水分散失[30]。苯丙素生物合成生物合成途径中的阿魏酰-5-羟基化酶、咖啡酸3-O-甲基转移酶等代谢物表达持续下调说明，随着采收期的延迟烟叶内木质素含量持续下降，导致叶片保水能力下降、细胞失水，为维持细胞渗透压平衡减少细胞失水，烟叶内Pro含量上升。

糖类物质含量对烟叶的感观质量、烟丝的质量及评吸时的香气和吃味有很大影响。糖类物质的积累是植物光合作用与呼吸作用相互作用的结果，淀粉和蔗糖是烤烟的主要内含物质，烤烟成熟期烟叶内淀粉快速合成、积累，代谢旺盛[31]。张树堂等[32]研究了不同采收成熟度对烤烟可溶性糖及品质的影响，发现随着采收时间的推迟和成熟度的提高，还原糖含量逐渐增加，达到某一高点后会降低。罗荣标[33]研究上部烟叶田间适宜采收成熟度生理指标研究时发现，延迟采收期会导致上部烟叶中糖类含量上升。本试验中延迟8 d采收时，烟叶中还原糖含量达到最高，继续延迟采收时间叶片内还原糖含量开始降低，这表明在延迟采收时间较短情况下植株成熟度增加，导致呼吸作用小于光合作用，糖类物质得到积累，而在延迟时间较长的情况下，还原糖含量下降导致植株内代谢功能下降。牛德新等[34]研究表明，随着烟叶的成熟，烟叶内淀粉含量呈上升趋势。杨胜男等[35]研究发现烟叶成熟期淀粉含量逐渐上升,至烟叶生理成熟期达到最高，随后淀粉含量下降。本研究中随着采收期延迟富集在淀粉和蔗糖途径中的代谢物表达量呈先下调再上调表达，延迟8 d采收时上部叶中富集在淀粉和蔗糖代谢途径中的代谢物开始呈下调表达，说明采收期推延8 d，烟叶内部淀粉合成和积累量达到最高，延迟超过8 d后代谢减慢，烟叶逐渐衰老，糖类物质作为能量被消耗，从而含量下降。

烟叶生长发育过程中各类化学成分的形成离不开氮代谢，氮代谢对烟叶产量和品质的形成与提高有重大影响。D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢是植物氮代谢中的关键代谢途径，随着采收期的延长，富集在此途径的谷氨酸脱氢酶等差异代谢物呈下调变化，已有研究表明谷氨酸脱氢酶在氮、磷胁迫下表达量不同[36]，也有研究结果表明在逆境胁迫下该酶主要在碳氮代谢中发挥重要调控功能[37]，本研究通过分析延迟采收条件下烟叶中的代谢物发现，随着采收期延长富集在D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢途径中的主要代谢物表达量下调，通过测定氮代谢关键酶活性指标发现，NR和GS活性随着采收期的延长逐渐降低，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢等氮代谢途径中关键代谢物表达量的下调说明氮代谢随着采收期延长逐渐减弱，这也是造成谷氨酸脱氢酶、NR和GS等氮代谢过程中关键酶活性降低的内在因素。这与王寒等[38]提出随着推迟采收时间的延长，顶叶叶片NR活性显著下降的结果一致。

托品烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成途径与不饱和脂肪酸的生物合成途径中的显著富集代谢物随着采收期的延迟，表达量呈下调变化。其中托品烷、哌啶和吡啶生物碱途径中发生变化的腐胺N-甲基转移酶是合成烟碱的关键酶[39-40],而烟碱是烟草中特有的生物碱，是烟叶质量形成的重要化合物[41]，说明延迟采收会抑制烤烟生物碱的合成与能量代谢，降低上部叶中生物碱含量，平衡上部烟叶内在化学成分。亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸会增加烟叶的刺激性，对烟叶的品质和风味有重要的影响[42-43]。本研究中延迟采收过程中棕榈油酸、油酸和亚麻酸等在不饱和脂肪酸合成途径中呈下调表达，说明随着上部烟叶的成熟，烟叶中高级脂肪酸含量呈大幅度降低趋势。宫长荣等[44]研究也发现，随着烟叶成熟度的提高，烟叶内棕榈油酸、油酸和亚麻酸含量持续下降。可见，延迟采收能够降低烟叶内不饱和脂肪酸含量，降低上部烟叶的刺激性。

4 结论

本研究综合生理和代谢组学两个方面对延迟采收下的上部烟叶成熟度进行评价分析，发现延迟采收能够减弱上部烟叶抗逆性、降低氮代谢，抑制不饱和脂肪酸的生物合成以及托品烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成，减少烟叶刺激性，降低烟碱含量，糖类物质含量在延迟8 d时积累量达到最高。由此可得出，豫中烟区上部叶延迟采收8 d时，烟叶生理和代谢方面达到采收最佳状态。