气相色谱质谱法检测动物源食品中游离氨基酸的含量

张 燕，邱禹侨，谭芳涛，丁华宇，顾晓辰，刘静波

（吉林大学食品科学与工程学院，吉林长春 130062）

0 引言

随着文化水平的不断提高，人们的精神与物质生活也在逐渐改善，从早饭吃得饱到精神上吃得好，合理膳食，均衡营养也开始逐渐受到了社会各界的广泛重视和关注。

氨基酸作为人体生命新陈代谢形成过程中的重要物质基础，对于生物大分子的活性及其作用、对生理功能的发挥作用及其效果显得极为重要。游离氨基酸不仅是动物源食品中重要的营养成分，还因为其可以与还原糖发生酶类或者非酶反应生成杂环类化合物，这些杂环类化合物具有独特的香味，游离氨基酸对动物源食品感官品质也有较大的影响。因此，游离氨基酸的检测对于合理利用动物源食品原料及食品品质的改善均有重要意义[1-2]。

目前，氨基酸含量的测定方法主要有氨基酸分析仪、气相色谱、液相色谱法及离子色谱法等[3-8]。气相色谱-质谱法（GC/MS）是一种操作简单并被广泛使用的分析方法。硅烷化衍生化方法是目前适用气相色谱对样品进行处理的过程中被使用的最广泛的方法，硅烷化反应通常是在几分钟内完成，随后可直接进行气相色谱分析，硅烷化试剂BSTFA反应性强，并且污染性较小，已被应用于烟草等游离氨基酸的检测中[9]。但是，利用BSTFA对动物源食品中游离氨基酸衍生化的报道较少。因此，采用BSTFA硅烷化衍生与气相色谱-质谱联用进行动物源食品：新鲜猪肉（畜类肉）、新鲜鸡蛋（禽类蛋白）、新鲜奶酪（乳制品）中游离氨基酸的分析应用研究。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

猪肉、鸡肉、奶酪、奶粉，均为市售；乙腈（色谱纯），美国飞世尔公司提供；氨基酸标准品（99%），Sigma公司提供；BSTFA+TMCS，99∶1硅烷化衍生，美国SUPELCO公司提供；浓盐酸、无水乙醇，均为分析纯。

GCMS-2010 PLUS型气相色谱质谱联用仪（GC/MS），日本岛津公司产品。

1.2 GC/MS分析

气相色谱条件：HP-5型毛细管色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；入口温度 260 ℃；进样量 1 μL；柱流速1.0 mL/min；分流方式：不分流；加热控制程序：初始温度保持在60℃下保持3 min，之后再以10℃/min的升温速率继续升高至100℃，然后以5℃的升温速率持续升高到200℃，再以20℃/min的升温速率继续升高至280℃，保持15 min。

质谱条件：离子溶剂延迟时长8 min，四极杆的电离能模式：EI源，电压设定为70 eV，扫描方式需要选择离子扫描的方式。

1.3 样品处理与衍生

（1）鲜猪肉的加工处理。选择一定质量的待测猪肉，用绞肉机将其均匀磨碎，准确称质量5 g（精确到0.001 g），加15 mL蒸馏水，均质后，以转速2 000 r/min离心，将混合之后的上清液均匀地转移到烧杯中，向残留物中加入15 mL蒸馏水，摇匀、离心，将上清液混合，并用离心机重复。将混合后的残留物和上清液均匀转移至50 mL容量瓶中，然后在确定体积后装瓶，备用。

（2）新鲜鸡蛋加工处理。将蛋清、蛋白混合均匀，选择一定质量的待测混合物，用打蛋机搅匀，准确称质量5 g（精确到0.001 g），加入15 mL蒸馏水，均质器均质，以转速2 000 r/min离心处理，将混合均匀的上清液转移到烧杯中，然后再向残留物质中添加15 mL的蒸馏水，摇动、离心，混合上清液，然后再次重复之前的步骤。将上清液均匀转移至50 mL的容量瓶中，备用。

（3）新鲜奶酪的称量过程。精确称质量后，将5 g（精确到0.001 g）新鲜奶酪放入到离心管中，加入15 mL蒸馏水，均质器均质，以转速2 000 r/min离心，再将上清液均匀地转移到烧杯中，向残留物中加入15 mL蒸馏水，摇动、离心，混合上清液；再次离心，将混合的上清液转移到50 mL的容量瓶中，备用。

将100 μL的上层离心溶液移入样品瓶中，冷冻干燥后，分别向这3个样品中添加100 μL乙腈和100 μL BSTFA硅烷化试剂，涡旋振荡3 min。在密闭状态100℃条件下进行衍生化反应30 min。衍生化反应完成后，冷却至一定室温后，可以进行气相色谱质谱分析。

2 结果与分析

2.1 氨基酸的标准曲线绘制

吸取 10，20，50，100，200，250，500，1 000 μL混合氨基酸的标准储备溶液到10 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L的盐酸溶液将其稀释得到不同质量浓度梯度的氨基酸混合标准溶液。再吸取100 μL氨基酸标准溶液，待溶剂完全蒸发（冷冻干燥处理）之后，添加750 μL BSTFA硅烷化衍生试剂和750 μL乙腈（7.5次），然后在101℃下进行硅烷化衍生化反应30 min。硅烷化反应结束后，溶液在4℃的条件下冷却。将不同质量浓度的氨基酸混合标准溶液进行气相色谱质谱回归分析。

分析游离氨基酸保留时间（tt），校正方程式和相应的相关系数（R2）见表1。

表1 分析游离氨基酸保留时间（tt），校正方程式和相应的相关系数（R2）

2.2 衍生物质的稳定性

用BSTFA对样品中的游离氨基酸衍生化。获得主要的衍生化产物就是三甲基甲硅烷基（TMS）的衍生物。在选择性离子质谱（SIM）模式的条件下，会得到基于TBDMS的衍生物。通过对EI离子质谱监测结构的化学特性和结构进行分析得出的鉴定结果表明，该产品具有良好的稳定性，且易于检测。因此，表明该方法可用于动物源食品中游离氨基酸的检测。

2.3 所选用样品的检测

样品中游离氨基酸检测结果如下。

新鲜猪肉中游离氨基酸见图1，新鲜鸡蛋中游离氨基酸见图2，新鲜奶酪中游离氨基酸见图3，样品中游离氨基酸含量见表2。

图1 新鲜猪肉中游离氨基酸

图2 新鲜鸡蛋中游离氨基酸

图3 新鲜奶酪中游离氨基酸

由表2可知，游离氨基酸总含量最高的是奶酪（122 mg/100 g·dw），其次是鸡蛋 （121 mg/100 g·dw），游离氨基酸含量最少的是猪肉（106 mg/100 g·dw）。

表2 样品中游离氨基酸含量/mg·（100 g）-1

2.4 结论

2.4.1 食品中游离氨基酸提取温度分析

考虑到室温条件下蛋白酶可能会使样品中的蛋白质水解而影响其中游离氨基酸的测定，试验研究了室温和4℃冷藏条件对样品中游离氨基酸含量的影响。通过比较结果，2种温度下3种样品测定的游离氨基酸含量无明显差别，因此为了方便检测选择了室温条件下检测。

2.4.2 食品中游离氨基酸提取试剂分析

结果表明，有15种以上的氨基酸用0.1 mol/L HCl进行提取时，含量和效率是最高的，提取量和效果较好。而氨基酸衍生反应的含量和效率与衍生反应的条件好坏有着密切关系，反应的温度、酸碱变化的程度、时间和反应试剂的种类等一系列因素都会对氨基酸衍生反应的效果有直接影响。结果表明，在酸性条件（HCl，0.1mol/L） 和碱性条件的情况下也可能会明显降低诸如丝氨酸、谷氨酰胺等氨基酸的含量和衍生化反应效率，而一般使用超纯水配制的氨基酸在提取的时候则具有较高的含量和衍生反应效率。