刺五加枸杞胶囊对小鼠免疫功能的影响研究

迟 明，刘 霞，李光英，毛海峰，刘 洋

（1.青海省轻工业研究所，青海西宁 810001；2.天津科技大学，天津 300457）

随着科学技术与经济社会的发展，快速的工作节奏和超负荷的工作，处在亚健康状态的群体渐渐增加[1]。世界性癌症研究原始数据调查报告显示，现如今世界上处在健康状态的人不足5%，处在患病的非健康状态的群体小于20%，高达75%的群体处在亚健康状态[2]。许多欧美国家早已将亚健康与艾滋病并列，称其为21世纪影响人类健康最大的因素。大量研究说明，人体的各种亚健康状态应由神经-免疫-内分泌的自我调控机制来改变[3]。因此，如何改善机体的免疫能力、改变亚健康状态成为了研究的热点课题。

中药成分是古代我国瑰宝，中药主要成分中的多糖和其他活性物质可以通过提高吞噬机体的功能，增加了机体淋巴系统的机能，提高了机体的白细胞介素和干扰水平，提高了机体的免疫力。刺五加在中国古代医药理论中作为一种重要的药物广泛使用已有悠久的文化和历史，具有“补中益精、坚筋骨、强志意”的重要作用，《本草纲目》中有明确的说法，刺五加在中华民族中带有“补中益气，坚筋骨，弱意志，久服轻身耐老”的重要效用[4]。刺五加还包括了心脑血管系统、神经系统、内分泌系统、自我反应和生理系统、免疫活动调控、抗癌、保护肝脏、防止衰老、抵御氧化、防治炎症、抗应激等活性，已在临床中广泛应用[5]。

枸杞是我国药食两用的传统名贵中药材，有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等多种功能[6-7]。刺五加、枸杞都具有提高机体免疫功能的作用，但两者配伍使用相关研究未见报道。因而，通过研讨刺五加枸杞配伍的胶囊对于大鼠免疫基本功能的影响，明确不同剂量刺五加枸杞配伍的胶囊对于人体免疫基本功能的影响，为刺五加及枸杞新商品的开发提供参与。

1 材料与方法

1.1 材料

刺五加枸杞胶囊，陕西秦巴山区天然中草药研究开发中心有限公司提供，由刺五加、枸杞等为原料制成，人体推荐量2.1 g/d，折合刺五加生药3.0 g/d，枸杞生药3.6 g/d。

1.2 试验动物

第四军医大学实验动物中心提供试验的研究小鼠，SPF级雄性昆明种小鼠，体重18～22 g。

200只雌性小鼠，每组40只小鼠被随机划分为4个小组。分别设计0.35 g/kg·BW（低剂量组），0.70 g/kg·BW（中剂量组），1.05 g/kg·BW（高剂量组3个用药量组和阳性对照组，蒸馏水组视为该次试验的阳性对照组。各组动物按照剂量每天灌胃1次，容量是20 mL/kg·BW，阴性对照组灌入等量蒸馏水，持续灌胃30 d。

1.3 试验方法

1.3.1 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法）[8]

小鼠经口灌服刺五加枸杞胶囊及去离子水30 d后处死小鼠，在无菌前提下取脾胃并放到无菌Hank's液平皿中，磨碎之后做成细胞培养液。过滤后用Hank's液洗2次，以转速1 000 r/min离心10 min，计数活细胞数（95%）以上，调节细胞浓度至3×106个/mL。每一份脾细胞膜培养液均设置2个套管（1 mL/孔），一孔内再加ConA液75 μL（份额为7.5 μg/mL），一组安放于37℃、5% CO2的培养箱中展开72 h的培养。在培养完毕之后的4 h，小心吸去各个孔0.7 mL的上清液，接着引入RPMI1640悬液0.7 mL（不含小牛血清），同时在每个孔中加入50 μL的MMT（5 mg/mL），4 h后再每个孔中加入1 mL的酸性异丙醇，混合均匀后测定其在波长570 nm的OD值。

1.3.2 二硝基氟苯（DNFB）诱导小鼠迟发型变态反应 （DTH）[9]

样品小鼠在第26天时腹腔注射，注射2%（V/V）SRBC（0.2 mL/只）进行致敏，于免疫后第4天每鼠左右足跖部皮下注射20%（V/V） SRBC（20 μL/只）进行攻击，并与攻击前和攻击后的24 h分别测量每只小鼠的足跖同一部位的厚度值。计算厚度差值，进行方差分析。

1.3.3 血清溶血素的测定[10]

选取羊血，使用生理盐水洗涤羊血3次，每次洗涤过后以转速2 000 r/min离心10 min。小鼠盆腔注射0.2 mL、2%（V/V） 的细胞培养液。免疫后的4～5 d摘眼球采血、分离血清。稀释血浆倍比使用盐水，微量血凝板内每一孔引入100 μL的不同稀释度的血浆，而后再引入100 μL的0.5%（V/V） SRBC培养液，倒入湿润的平盘内后在37℃的温箱中孵育3 h前展开血浆溶血素测定。

1.3.4 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验（半体内法）[11]

小鼠经口灌服低聚肽蜂花硒粉和蒸馏水30 d后，小鼠/组进行腹腔注射鸡红细胞悬液（1 mL，20%（V/V），颈椎脱臼处死小鼠，每一只小鼠经腹腔注入2 mL的生理盐水，接下来转动1 min鼠板，然后将吸出的腹腔洗液（1 mL） 平均分开，滴在2片玻片上，将其摆放到垫有湿纱布的搪瓷盒内，37℃的前提下温育30 min。孵毕后使用生理盐水将其进行漂洗、晾干。去离子水漂洗擦拭之后展开镜检，在油镜之下计量100个巨噬细胞，计算吞噬率、吞噬指数。

1.3.5 小鼠碳廓清试验[12]

大鼠末次给药完毕后1 h，展开尾静脉的注射（印度墨汁10 mL/kg·BW：盐水3.5倍稀释），注射墨汁后2，10 min分别内眦静脉丛采血20 μL，迅速加入到碳酸钠溶液（0.1%，2 mL） 中混合均匀。对照为碳酸钠溶液，于波长600 nm处测定OD值。取处死前大鼠的肝脏和脾脏，使用滤纸拭干器官表层的血污，而后分别称质量并记录计算结果。计算吞噬指数（a），如果受试试样组的吞噬指数明显低于对照组，亦可判定结果为阴性。

1.3.6 抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）[13]

取脱纤维羊血，选用蒸馏水洗濯3次脱纤维羊血，每天洗濯之后也以转速2 000 r/min离心10 min，每次仅小鼠经胸腔注射0.2 mL的2%（V/V） SRBC。SRBC自己免疫4 d之后小鼠处死之后拔出其脾脏，放到一个盛装难的具有Hank's液的小平皿中，小心地磨碎其脾脏，做成一种细胞培养液，过滤前以转速1 000 r/min离心10 min，用Hank's液洗2遍，之后将其细胞核性悬浮于RPMI1640菌液5 mL中，计数到细胞，并将细胞的浓度调整到5×106个/mL。

空斑的测定：将培养基（1 g琼脂糖加双蒸水至100 mL） 的表面层加热溶解以后，放置到45～50℃进行水浴保温，与等量的pH值7.2～7.4，2倍含量的Hank's液混合之后再展开分装，每个管0.5mL，管内应该引入50 μL，10%（V/V） 的SRBC（选用SA溶液制备而是变成），20 μL的5×106个/mL脾细胞膜培养液，快速混匀前将其倾倒于刷了琼脂糖薄层的玻片之上展开平行试验，琼脂凝结前置于片架上固定。再摆放到CO2培养箱展开1.5 h的孵育，接下来再将份额为1∶8的SA缓冲液稀释补体引入玻片架的凹槽内，继续展开1.5 h的育温。记录溶血空斑的数目。不同用量组的结果应当与阳性对照组比较展开方差分析。

1.3.7 NK细胞活性测定[14]

试验前24 h需要进行靶细胞的传代培养。使用前用Hank's液洗3次，调整细胞膜pH值为4×105个/mL。取脾制成单细胞悬液。过滤后用Hank's液洗2次，每次清洗后都以转速1 000 r/min离心10 min。将细胞膜浆弹起，而后加入0.5 mL清洗空气（20 s），血小板裂解前再加入2倍的0.5 mL Hank's液和8 mL Hank's液，以转速1 000 r/min离心10 min，而后选用富含10%小牛血浆的RPMI1640完全培养基（1 mL） 重悬，溶解之后计量（活细胞核数应当在95%以上），再用台盼蓝染色记录活细胞数（应在95%以上），最后调整细胞浓度为2×107个/mL，调整细胞浓度使用RPMI1640完全培养液。

分别取10 μL的靶细胞及效应细胞膜引入到U型的96孔培养板中：靶细胞自然开释孔分别加100 μL的靶细胞和菌液，加10 μL靶细胞最大开释孔加靶细胞和1% NP40；各项设置3个平行孔做平行试验，于37℃、5% CO2培养箱中培养4 h，然后将96孔培养板以转速1 500 r/min离心5 min，每一孔汲取上清100 μL安放到平底的96孔培养板中；另一方面引入100 μL的LDH基质液，反应时间为8 min，在每一孔中引入1 mol/L的HCl溶液30 μL，于波长490 nm处测定OD数值。计算NK细胞核活性，如果各个剂量组结果明显低于阳性对照组判别结果阴性。

2 结果与分析

2.1 刺五加枸杞胶囊剂量小鼠体重的影响

不同剂量刺五加枸杞胶囊在迟发型变态反应（DTH）、小鼠测定及胰腺脏器/体重乘积测定及碳化廓清试验、ConA诱导的小鼠脾胃淋巴细胞转化试验及NK细胞核活性测定、抗原生成细胞核测试及血浆溶血素测定及小鼠胸腔巨噬细胞吞噬羊血小板试验的5组试验中，体重都没有明显区别。由此可见，剂量对小鼠体重的作用效果较小。

图1 各剂量组刺五加枸杞胶囊对试验一组小鼠体重的影响（±s）

2.2 刺五加枸杞胶囊剂量对小鼠淋巴器官/比重比值的影响

各剂量组刺五加枸杞胶囊对小鼠淋巴器官/比重比值的影响 （±s） 见表1。

表1 各剂量组刺五加枸杞胶囊对小鼠淋巴器官/比重比值的影响 （±s）

表1 各剂量组刺五加枸杞胶囊对小鼠淋巴器官/比重比值的影响 （±s）

组别 剂量/g·（k g·B W）-1动物数/只胸腺/体重/×1 0-3 p值 脾脏/体重/×1 0-3 p 值高剂量组中剂量组低剂量组阴性对照组1.0 5 0.7 0 0.3 5 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0.3 3 2±0.0 4 0 0.3 2 7±0.0 5 4 0.3 0 8±0.0 4 3 0.3 1 9±0.0 6 2 0.9 9 9 0.9 9 3 0.7 1 3-0.4 2 3±0.0 2 8 0.4 2 5±0.0 5 3 0.3 9 5±0.0 4 3 0.4 0 6±0.0 5 0 1.0 0 0 0.9 9 3 0.4 4 1-

由表1可知，高剂量组和中剂量组试验小鼠的胸腺/比重比值和脾脏/体重均略高于对照组，说明一定剂量的添加，可以促进小鼠的生长，能够对小鼠的身体状况形成影响。相对来说，低剂量组的实验小鼠胸腺/比重比值和脾脏/体重略低于对照组但是没有太大的差别，可能是由于剂量较低，还没有能对小鼠的内部关于淋巴器官的细胞形成影响时就已经被分解，从而几乎没有影响。总的来说，不同剂量的五加枸杞胶囊对小鼠的淋巴器官和体重的影响整体相对较小。

2.3 刺五加枸杞胶囊剂量对小鼠脾淋巴细胞转化能力及小鼠迟发型变态反应的影响

各剂量组刺五加枸杞胶囊对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力及小鼠迟发型变态反应的影响（±s） 见表 2。

由表2可知，处理组呈现随着刺五加枸杞胶囊剂量的增加，ConA诱导的脾淋巴细胞增殖OD差值逐渐增大的趋势，说明刺五加枸杞胶囊剂量越高，越能加强脾淋巴细胞增殖，但是也可以看到，试验数据变化不明显，可能是由于本身ConA诱导受刺五加枸杞胶囊剂量外来刺激的变化较小，使自身的诱导基本上不受影响。另外，足跖厚度差值的试验数据看出，随着刺五加枸杞胶囊剂量的增加，试验小鼠的足跖厚度差值逐渐增加。其中，中、高剂量的刺五加枸杞胶囊试验组增长幅度较大，与对照组差别较为明显，说明较高的刺五加枸杞胶囊剂量对小鼠的足跖厚度影响较大。

表2 各剂量组刺五加枸杞胶囊对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力及小鼠迟发型变态反应的影响（±s）

表2 各剂量组刺五加枸杞胶囊对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力及小鼠迟发型变态反应的影响（±s）

组别 剂量/g·（kg·BW）-1动物数/只ConA诱导的脾淋巴细胞增殖OD差值p值 足跖厚度差值/mm p值高剂量组中剂量组低剂量组阴性对照组1.05 0.70 0.35 0 10 10 10 10 0.113±0.016 0.111±0.011 0.104±0.010 0.099±0.010 0.029 0.061 0.621-0.737±0.085 0.694±0.035 0.651±0.087 0.648±0.071 0.025 0.362 0.999-

2.4 刺五加枸杞胶囊剂量对小鼠血清溶血素水平的影响

表3 各剂量组刺五加枸杞胶囊对小鼠血清溶血素水平的影响（±s）

表3 各剂量组刺五加枸杞胶囊对小鼠血清溶血素水平的影响（±s）

组别 剂量/g·（kg·BW）-1动物数/只血清溶血素（抗体积数） p值高剂量组中剂量组低剂量组阴性对照组1.05 0.70 0.35 0 10 10 10 10 181.60±10.63 179.60±10.67 168.70±16.17 166.80±7.85 0.021 0.051 0.969-

由表3可知，刺五加枸杞胶囊剂量的不同处理组呈现随着剂量的升高小鼠体内血清溶血素（抗体积数）逐渐增加的趋势。其中，刺五加枸杞胶囊低剂量处理与阴性对照组相比变化较小，然而，由试验数据可以看到，刺五加枸杞胶囊低中剂量和高剂量处理组中，试验小鼠的抗体积数增长幅度变大，且显著高于阴性对照组，数据说明，刺五加枸杞胶囊剂量的增加能够有效提升小鼠的血清溶血素水平，其中高剂量刺五加枸杞胶囊的使用效果最佳。可以猜测，随着剂量的再次增加，其抗体积数可能还会增加，但是同样也可能带来一定的副作用。

2.5 刺五加枸杞胶囊剂量对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响

各剂量组刺五加枸杞胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响（±s） 见表4。

由表4可知，不同剂量刺五加枸杞胶囊的处理随着剂量的升高，小鼠体腹腔巨噬细胞吞噬百分率逐渐增加的趋势。其中，刺五加枸杞胶囊的低剂量处理组与阴性对照组比较来说差异较小，说明低剂量的刺五加枸杞胶囊处理对小鼠的作用较小，然而试验数据表明，刺五加枸杞胶囊的中高剂量处理组对小鼠的腹腔的巨噬细胞的吞噬能力具有明显的促进作用，吞噬指数远高于阴性对照组，说明刺五加枸杞胶囊剂量的增加是对小鼠腹腔的巨噬细胞吞噬能力有积极的影响效果。

表4 各剂量组刺五加枸杞胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响（±s）

表4 各剂量组刺五加枸杞胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响（±s）

组别 剂量/g·（kg·BW）-1动物数/只吞噬百分率/% p值 吞噬指数 p值高剂量组中剂量组低剂量组阴性对照组1.05 0.70 0.35 0 10 10 10 10 42.58±3.35 40.33±2.42 38.40±2.63 38.50±3.36 0.011 0.386 0.988-0.907±0.076 0.838±0.100 0.780±0.110 0.759±0.098 0.005 0.186 0.818-

2.6 刺五加枸杞胶囊剂量对小鼠碳廓清功能的影响

表5 各剂量组刺五加枸杞胶囊对小鼠碳廓清功能的影响（±s）

表5 各剂量组刺五加枸杞胶囊对小鼠碳廓清功能的影响（±s）

组别 剂量/g·（kg·BW）-1动物数/只 吞噬指数a p值高剂量组中剂量组低剂量组阴性对照组1.05 0.70 0.35 0 10 10 10 10 5.363±0.670 5.291±0.347 5.106±0.529 4.701±0.491 0.021 0.043 0.227-

由表5可知，不同剂量刺五加枸杞胶囊对小鼠碳廓清功能作用效果都显著高于阴性对照组，并且呈现随着刺五加枸杞胶囊剂量的增加，试验小鼠的吞噬指数a逐渐增加的趋势，试验数据表明低、高、中剂量组相对于阴性对照来说，都能显著提高小鼠碳廓清的吞噬指数a，说明其中刺五加枸杞胶囊对小鼠的碳廓清功能这一方面具有明显的增强作用，可以有效提升吞噬指数a，刺五加枸杞胶囊的高剂量处理组对试验小鼠的作用效果最为明显。

2.7 刺五加枸杞胶囊剂量对小鼠抗体生成细胞功能的影响

表6 各剂量组刺五加枸杞胶囊对小鼠抗体生成细胞功能的影响 （±s）

表6 各剂量组刺五加枸杞胶囊对小鼠抗体生成细胞功能的影响 （±s）

组别 剂量/g·（kg·BW）-1动物数/只溶血空斑数（个/106脾细胞） p值高剂量组中剂量组低剂量组阴性对照组1.05 0.70 0.35 0 10 10 10 10 974.00±127.04 943.00±92.62 877.00±96.50 824.00±102.00 0.008 0.042 0.544-

由表6可知，不同剂量的刺五加枸杞胶囊处理组对试验小鼠抗体生成细胞功能作用效果都显著高于阴性对照组，且呈现随着刺五加枸杞胶囊处理剂量的增加，试验小鼠的溶血空斑数（个/106脾细胞）逐渐增加的趋势，试验数据说明刺五加枸杞胶囊处理组促进了小鼠体内抗体生成细胞数量的增加，差异性显著（p＜0.01，p＜0.05）。其中，中、高剂量的刺五加枸杞胶囊处理组显著高于阴性对照组的溶血空斑数，说明了这2个处理组对小鼠体内抗体生成细胞功能具有明显促进作用，且高剂量组的刺五加枸杞胶囊使用效果最佳。

2.8 刺五加枸杞胶囊剂量对小鼠NK细胞活性的影响

表7 各剂量组刺五加枸杞胶囊对小鼠NK细胞活性的影响（±s）

表7 各剂量组刺五加枸杞胶囊对小鼠NK细胞活性的影响（±s）

组别 剂量/g·（kg·BW）-1动物数/只NK细胞活性/% p值高剂量组中剂量组低剂量组阴性对照组1.05 0.70 0.35 0 10 10 10 10 41.75±3.76 41.38±3.97 40.04±3.18 40.52±3.22 0.665 0.845 0.967-

由表7可知，虽然试验组整体呈现随着刺五加枸杞胶囊剂量的增加，其NK细胞活性随之增大的趋势，但是对比阴性对照组来说，刺五加枸杞胶囊剂量对小鼠NK细胞的活性影响不大。其中，中、高剂量的刺五加枸杞胶囊处理对小鼠NK细胞活性具有一定的促进作用，但效果不显著，反而可以看到低剂量的刺五加枸杞胶囊处理对小鼠NK细胞活性相对于阴性对照组活性还有所降低。说明刺五加枸杞胶囊本身对小鼠NK细胞活性影响不大，不调控NK细胞的活性。

3 结论

免疫能力降低是亚健康群体的主要体现方法，主要是由于人们紧张的、不规律的生活状态所致。随着人们对品质生活追求的不断提高，对自身的身体健康状态也越来越重视，为了有效改善身体的亚健康状态，许多人选择服用保健品提高自身免疫力[15-16]。针对现代人群亚健康状态及免疫力降下降的问题，以刺五加、枸杞为主要原料，开发了增强机体免疫力的刺五加枸杞胶囊，并对小鼠进行一系列提高免疫力的试验。

结果表明，各剂量组小鼠各期体重、小鼠胸腺/比重比值和脾脏/体重比值及小鼠NK细胞活性无明显变化。与对照组相比较来说，高用药量组能够显著提升ConA诱导的大鼠脾胃淋巴细胞转化能力、抗原积数、吞噬率及吞噬指数；高用药量组以SRBC攻击后大鼠组足跖间距比值比吸收剂对照组显著变大，差异显著（p＜0.05）。与对照组比较，高、中用药量组能显著提高大鼠碳廓清吞噬指数、抗原生成生物体数目，差异显著（p＜0.05）。试验数据表明，综合整体来看，随着刺五加枸杞胶囊剂量的增加，试验结果均呈现较好的趋势，且高剂量刺五加枸杞胶囊的处理组相对于阴性对照组来说，作用效果尤为明显，且使用效果最佳。

按照《保健食品检验与技术评价规范》 （2003）版能判断，该类商品对细胞膜免疫功能测定和机体免疫功能测定结果均为阳性，该类商品有着提高免疫能力的效用。试验结果显示，由枸杞、沙棘配伍的产品不良反应较少，不会破坏机体正常的免疫功能，安全性高且效果好，可为后续刺五加枸杞的产品开发及广泛应用提供有力的佐证。目前，对于刺五加、枸杞提高免疫力方面机制及作用研究都较少，还需进行大量试验。因此，可加强对这2种中药的基础研究，为其进一步临床应用及资源开发提供科学依据。