MiR-17促进胃癌细胞上皮间质转化机制

苏 晖，徐王彦，刘忠臣

(1.安徽理工大学医学院，安徽 淮南 232000；2.上海第十人民医院胃肠外科，上海 200072)

胃癌是常见的恶性消化道肿瘤之一，也是我国最常见的第二大恶性肿瘤。肿瘤的治疗原则在于早发现、早诊断、早治疗，所以寻找新的生物标记物对预防治疗胃癌有着重要意义 。

研究表明肿瘤转移的关键环节在于癌细胞的上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，此过程中，肿瘤细胞的上皮样功能减退，向间质样功能转变，并伴随着细胞迁移和侵袭能力的增强。研究发现EMT与肿瘤分期、高复发率、低生存率显著相关。并且MicroRNA(miRNA)与肿瘤转移密切相关。此外，在胃癌中，miR-17通过调节CYP7B1的表达，使上皮间充质转化，加速肿瘤转移；并且miR-17靶向SRC激酶信号传导抑制剂1促进人骨肉瘤细胞的增殖和上皮间质转化。近期研究表明，miR-17在胃癌组织以及胃癌细胞中表达上调，并与全身转移密切相关。但在胃癌的转移上，miR-17是如何对EMT进行干预的过程不得而知，其对治疗和预防胃癌方面有着重要的意义。

因此，本研究将进一步探究胃癌进程中miR-17的表达及通过双向调控miR-17表达，探究其对胃癌细胞增殖、侵袭和EMT的调控作用，阐明miR-17调控胃癌细胞转移分子机制，为胃癌的预防治疗提供新的参考思路。

1 材料与方法

(1)试验材料

人胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823、HGC-27以及正常胃粘膜上皮细胞GES-1购自中国科学院细胞库；胎牛血清、RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)、BCA法蛋白提取试剂盒购自碧云天生物科技公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司；细胞蛋白裂解液RIPA购自Vazyme公司，β-actin、E-cadherin、vimentin、TGFBR2、PTEN、PI3K以及AKT一抗购自美国Abcam公司；荧光素酶报告载体PGL3购自美国Promega公司；ABI7500 PCR仪购自美国AppliedBiosystems公司；SYNGENE全自动图像分析系统购自美国GENE公司；蛋白电泳系统购自美国Bio-Rad公司；所有引物序列由上海生工公司设计合成。

(2)试验方法

1)样本采集 收集本院自2018a 1月～2020a 4月经手术切除并经病理证实的胃癌石蜡标本共35例。其中男19例、女16例，年龄35～72岁，中位年龄59.8岁，组织病理类型的判断标准参照WHO胃癌的病理学分类，每例标本取肿瘤组织及距肿瘤边缘5cm以上的癌旁胃黏膜组织作为对照组。所有受试者均签署知情同意书。本研究方案获得医院伦理委员会批准。

2)细胞培养与转染 用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基孵育细胞，待细胞融合度达约85%时传代。转染前1d，取生长状态良好的SGC-7901细胞以2×10个细胞/孔的密度接种于6孔板，当细胞密度达约60%时进行转染。使用Lipofectamine 2000将miR-17模拟物或抑制剂及其阴性对照，以及TGFBR2过表达载体或siRNA及其阴性对照转染入SGC-7901细胞中，转染后继续培养，用于后续实验。

3)RT-qPCR检测基因mRNA水平 使用TRIzol从细胞分离总RNA，用PrimeScript试剂盒合成单链cDNA，通过使用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒进行实时PCR，反应在ABI7500实时PCR系统中进行。U6用作内源对照。定量分析采用2法进行。

4)MTT法检测细胞增殖 用胰蛋白酶消化对数期细胞，用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1 000～10 000个细胞接种，37℃温育，分别于24h、48h和72h向每孔中加入20μL MTT溶液，继续培养4h；终止培养，对悬浮细胞需离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。在490nm波长处测量每孔的吸光度。

5)Transwell小室实验检测细胞侵袭 将细胞维持在补充有10% FBS的RPMI-1640培养基中，并将100μL密度为1×10细胞接种在具有Matrigel的小室中和具有聚对苯二甲酸乙二醇酯膜的对照物上，孵育24h后用先用无水甲醇固定20min，再用结晶紫染色20min，干燥后用倒置显微镜观察，计数评估细胞侵袭能力。

6)Western blotting检测蛋白的表达 用RIPA裂解液提取细胞的蛋白质匀浆，使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质含量。以15μg/泳道的上样量通过12% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质并转移到PVDF膜上。将膜在TBST溶液中于25℃封闭3h，然后与一抗4℃过夜孵育。在ECL方案之前，使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗兔或抗鼠IgG将条带可视化。

7)荧光素酶报告基因分析 用StarBase3.0预测miR-17和TGFBR2之间的关系(http://starbase.sysu.edu.cn/)。将TGFBR2的野生型和突变型3′-UTR序列分别克隆到含有萤光素酶报道基因的PGL3载体中。将人胚胎肾细胞293(HEK293)接种在24孔板中，当生长至约70%汇合时，使用Lipofectamine 2000与荧光素酶质粒和miR-17模拟物或阴性对照共转染。转染24h后收集细胞，通过Dual-luciferase reporter Assay System测量荧光素酶分子的活性。

8)流式细胞术检测细胞凋亡 收集细胞并用PBS洗涤两次。将总共1×10个细胞/mL的细胞悬浮液(100μL)转移至培养管中，然后与5μL膜联蛋白V-FITC和5μL碘化丙啶于室温下避光温育20min。最后，加入400μL结合缓冲液，通过流式细胞仪(BD Biosciences，USA)测定凋亡细胞。

9)动物试验 成年SD大鼠(220～250g)由河南实验动物中心提供。将所有动物圈养在光循环控制环境中的单独笼子中，自由获取食物和水。将30只SD大鼠随机分为对照组(转染NC mimic的SGC-7901细胞)和处理组(转染miR-17mimic的SGC-790细胞)，每组15只，腹腔注射。在注射后第15d、20d、25d、30d和35d，每组安乐死3只小鼠，取肿瘤组织测定肿瘤体积和重量。所有动物护理和实验程序均经安徽理工大学伦理委员会批准。

2 结果

(1)miR-17在胃癌组织及细胞系表达上调

收集35对胃癌患者的肿瘤组织和癌旁组织，通过实时定量RT-qPCR检测miR-17的表达水平。结果表明，与癌旁组织相比，胃癌组织中miR-17的表达显著上调(

P

<0.01)(见图1(a))。此外，相较于正常胃粘膜上皮细胞GES-1，胃癌细胞中miR-17的表达水平同样显著增加(

P

<0.01)(见图1(b))。

(a)不同组织miR-17的相对表达量 (b)不同细胞miR-17的相对表达量图1 胃癌组织和胃癌细胞系miR-17的表达水平

(2)过表达或抑制miR-17对SGC-7901细胞的影响

在SGC-7901细胞中分别转染miR-17的模拟物或抑制物，转染效率如图2(a)所示，miR-17模拟物上调miR-17表达，miR-17抑制物下调miR-17表达。此外，MTT实验结果提示过表达miR-17显著增强SGC-7901细胞活力，干扰miR-17表达则显著抑制SGC-7901细胞活力(

P

<0.01)(见图2(b))。流式细胞分析表明转染miR-17模拟物抑制SGC-7901细胞凋亡，相反，抑制miR-17表达则促进细胞凋亡(

P

<0.01)(见图2(c)和(e))。除此之外，SGC-7901细胞的侵袭能力在过表达miR-17后显著增强，干扰miR-17表达细胞侵袭能力受到抑制(

P

<0.01)(见图2(d)和(f))。

(a)不同转染方式miR-17的相对表达量 (b)不同转染方式吸光光度值

(c)不同转染方式细胞凋亡情况值

(d)不同转染方式细胞侵袭情况

(e)不同转染方式细胞凋亡统计图 (f)不同转染方式细胞侵袭统计图图2 过表达或抑制miR-17对SGC-7901细胞的影响

(3)miR-17靶定TGFBR2的3’UTR

在线生物学信息分析(http://starbase.sysu.edu.cn/)结果提示miR-17与TGFBR2的3’UTR区域存在结合位点，其中，TGFBR2的野生型序列和突变型序列如图3(a)所示，红色区域为配对碱基，蓝色区域为突变碱基。接下来，荧光素酶报告基因分析验证了miR-17与TGFBR2之间的靶向关系(见图3(c))。为进一步验证miR-17能够与TGFBR2相互靶定，将miR-17模拟物或抑制物分别转染到细胞中，过表达miR-17抑制TGFBR2的表达，下调miR-17则显著促进TGFBR2的表达(

P

<0.01)(见图3(b)和(d))。

(a)TGFBR2的野生型 序列和突变型序列 (b)不同转染方式细胞的TGFBR2的表达情况

(c)荧光素酶报告基因分析 (d)不同转染方式细胞的TGFBR2的表达统计图图3 miR-17和TGFBR2靶向关系

(4)调控TGFBR2对SGC-7901细胞的影响

在SGC-7901细胞中分别上调或下调TGFBR2的表达，转染效率如图4(a)～(b)所示，转染TGFBR2过表达质粒上调TGFBR2表达，转染TGFBR2 siRNA下调TGFBR2表达。此外，MTT实验结果提示上调TGFBR2显著抑制SGC-7901细胞活力，下调TGFBR2表达则增强了SGC-7901细胞活力(

P

<0.01)(见图4(c))。流式细胞术结果表明转染TGFBR2过表达质粒促进SGC-7901细胞凋亡，相反，干扰TGFBR2过表达质粒表达抑制细胞凋亡(

P

<0.01)(见图4(d))。 除此之外， SGC-7901细胞的侵袭能力在转染TGFBR2过表达质粒后显著减弱， 干扰TGFBR2表达细胞侵袭能力增强(

P

<0.01)(见图4(e))。

(a)不同转染方式TGFBR2的表达情况 (b)不同转染方式TGFBR2的相对表达量 (c)不同转染方式吸光光度值

(d)不同转染方式细胞凋亡情况

(e)不同转染方式细胞凋亡统计图 (f)不同转染方式细胞侵袭统计图图4 过表达或干扰TGFBR2对SGC-7901细胞的影响

(5)MiR-17促进胃癌细胞上皮间质转化机制

为进一步探究miR-17调节TGFBR2的可能机制，在SGC-7901细胞中同时转染miR-17模拟物和TGFBR2过表达质粒。研究发现，转染TGFBR2过表达质粒显著逆转miR-17对TGFBR2表达的抑制作用(

P

<0.01)(见图5(a)和(b))。此外，miR-17模拟物能够促进SGC-7901细胞增殖(

P

<0.01)(见图5(c))，抑制细胞凋亡(

P

<0.01)(见图5(d)和(e))，促进上皮间质转化(

P

<0.01)(见图5(f)和(g))，而过表达TGFBR2后miR-17模拟物对细胞行为的调控作用显著被逆转。此外，Western blotting结果表明过表达miR-17抑制PTEN的蛋白表达，上调PI3K和AKT的磷酸化蛋白水平，这种变化在过表达TGFBR2后被逆转(

P

<0.01)(见图5(h)和(i))。

(a)不同转染方式TGFBR2的表达情况(b)不同转染方式TGFBR2的表达统计图 (c)不同转染方式吸光光度值

(d)不同转染方式细胞凋亡情况 (e)不同转染方式细胞凋亡统计图

(f)不同转染方式上皮问题转化蛋白表达情况 (g)不同转染方式上皮问题转化蛋白表达统计图

(h)不同转染方式通路蛋白表达情况 (i)不同转染方式通路蛋白表达统计图图5 miR-17与TGFBR2的相互作用

(6)miR-17促进SD大鼠肿瘤进展

将转染NC mimic或过表达miR-17 mimic的SGC-7901细胞腹腔注射到大鼠体内构建荷瘤大鼠模型，探讨miR-17诱导体内肿瘤形成的能力。如图6(a)所示，过表达miR-17的SD大鼠比对照组SD大鼠更易形成肿瘤(

P

<0.01)。此外，本观察到过表达miR-17的SD大鼠的肿瘤体积显著大于对照组SD大鼠肿瘤体积(

P

<0.01)(见图6(b))。 同样， 本观察到过表达miR-17的SD大鼠的肿瘤重量大于对照组SD大鼠肿瘤重量(

P

<0.01)(见图6(c))。

(a)不同组别大鼠肿瘤代表性图像 (b)不同组别大鼠肿瘤体积(c)不同组别大鼠肿瘤质量图6 miR-17促进SD大鼠肿瘤生长

3 讨论

上皮间质转化， 本质在于正常上皮细胞去极化， 失去与基底膜连接的表型， 逐渐转化为间质表型的生物学过程， 具有间质表型的细胞抗凋亡、 迁移和侵袭能力增强，与肿瘤的转移和复发密切相关。 肿瘤细胞向周围播散、 侵袭正常组织是瘤细胞演变成恶性肿瘤的关键表现， 对于多数肿瘤来说， 其向恶性发展的过程中总伴随着细胞上皮分化能力丧失，继而改向间质样表型转化。 在非小细胞肺癌中，肿瘤细胞的早期转移伴随着上皮标志物E-cadherin减少，间充质标志物波形蛋白和纤维蛋白增加。另有报道称E-cadherin的表达与肿瘤的分化程度和淋巴结转移呈负相关。裸鼠成瘤模型中，干扰E-cadherin表达促进肿瘤细胞成瘤，增强体内转移能力。

转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)是一种具有多种功能的细胞因子，具有调节细胞增殖、迁移、粘附以及胞外基质形成等多种生物学活性。据报道，TGF-β转导系统调控多种上皮细胞的生长分化，这些细胞受TGF-β受体表达的下降或缺失将导致细胞对TGF-β信号失去反应，从而导致肿瘤的发生。TGF-β相应的受体分为I型、Ⅱ型和III型，即TGFBR1、TGFBR2和TGFBR3。本研究发现，与癌旁组织相比，TGFBR2在肿瘤组织中表达显著下调，且E-cadherin减少，vimentin增加；当过表达TGFBR2后，E-cadherin增多，vimentin减少，是TGFBR2在胃癌细胞上皮间质转化中的具有重要作用。有研究报道了miR-155在SGC-7901细胞中的过度表达抑制了TGFBR2的表达，促进胃癌细胞的增殖和迁移。miR-181a的过度表达和TGFBR2的下调均促进了SGC-7901细胞的迁移和增殖，该结论在诱导胃癌小鼠时同样得到验证。一项关于130例原发性胃癌临床分析报告指出，约有42.3%的患者表现出TGFBR2表达完全丧失，与癌转移显著相关。以上报道更加支持了本研究结果，TGFBR2在胃癌的上皮间质转化中起重要的抑制作用。

PTEN(Phosphatase and tensin homolog)属于蛋白酪氨酸磷酸酶基因家族，作为重要的肿瘤抑制基因，其在肿瘤细胞生长、凋亡、粘附、迁移和侵袭中起重要作用。PTEN最重要的磷酸化底物是PIP3，是PI3K的产物并介导AKT的活化。PTEN的失活导致PI3K/AKT的激活，活化的AKT可促进肿瘤细胞的生长和增殖，抑制细胞凋亡，促进侵袭和转移，并通过催化一系列蛋白质磷酸化反应调节内皮细胞生长和血管生成。在肝母细胞瘤中，miR-19b抑制剂下调p-PI3K和p-AKT蛋白表达，但PTEN蛋白表达增加，进而抑制肿瘤的进展。Zhang等报道了lnc RNA MT1JP抑制增殖、侵袭和迁移，并通过激活PTEN/AKT信号通路促进胶质瘤细胞的凋亡。据此，PTEN负调控PI3K/AKT轴，是抑制胃癌细胞的上皮间质转化的作用基础。

本研究发现过表达miR-17下调TGFBR2，导致PTEN表达抑制，进而PI3K/AKT信号通路被激活，SGC-7901细胞侵袭能力增强，加速了肿瘤细胞的EMT。此外，体内研究结果证明miR-17促进肿瘤的生长。因此，miR-17可能成为胃癌潜在的治疗靶点。