酒五味子的指纹图谱建立及化学模式识别分析

2021-12-30李慧峰田凡玉孟霜孔祥鹏王兵裴妙荣

中国药房 2021年24期

李慧峰田凡玉孟霜孔祥鹏王兵裴妙荣

中圖分类号 R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）24-3008-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.24.11

摘要目的：建立酒五味子的指纹图谱，并进行聚类分析和主成分分析。方法：采用高效液相色谱（HPLC）法。以Diamonsil C18（2）为色谱柱，以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，检测波长为250 nm，流速为1 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。以五味子醇甲为参照峰，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》绘制15批酒五味子饮片样品的HPLC指纹图谱并进行相似度评价，确定共有峰。采用SPSS 22.0软件进行聚类分析、主成分分析。结果：15批酒五味子饮片样品共有20个共有峰，相似度为0.983～0.999;共指认出其中8个共有峰，分别为5-羟甲基糠醛、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素。聚类分析结果显示，15批酒五味子饮片可聚为4类，其中S1～S4、S14聚为一类，S9～S11聚为一类，S5、S7～S8、S12～S13聚为一类，S6、S15聚为一类。主成分分析结果显示，前4个主成分的累计方差贡献率为85.381%，分类结果与聚类分析结果基本一致。与生五味子比较，酒制后的五味子中新增了5-羟甲基糠醛，且含量较高，而其余色谱峰未见明显差异。结论：所建HPLC指纹图谱简便、易行，结合聚类分析和主成分分析可用于酒五味子饮片的质量控制。

关键词酒五味子;高效液相色谱法;指纹图谱;聚类分析;主成分分析

Establishment of HPLC Fingerprint of Wine-processed Schisandra chinensis and Analysis of Chemical Pattern Recognition

LI Huifeng1，TIAN Fanyu1，MENG Shuang2，KONG Xiangpeng1，WANG Bing1，PEI Miaorong1（1. College of Chinese Medicine and Food Engineering， Shanxi University of Chinese Medicine/Shanxi Modern Chinese Medicine Engineering Laboratory， Shanxi Jinzhong 030619， China; 2. Central Laboratory， Shanxi Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine， Taiyuan 030013， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the fingerprint of wine-processed Schisandra chinensis， and to conduct cluster analysis and principal component analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Diamonsil C18 （2） column with mobile phased consisted of methanol-water （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 250 nm， and the column temperature was 30 ℃; the injection volume was 10 μL. With schisandrol A as the reference peak， HPLC fingerprints of 15 batches of samples were drawn and their similarity were evaluated with Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition）. The common peaks were determined. Cluster analysis and principal component analysis were performed by using SPSS 22.0 statistical software. RESULTS： There were 20 common peaks in 15 batches of samples， and the similarities were 0.983-0.999; a total of 8 common peaks were identified， namely 5-hydroxymethyl furfural， schisandrol A， schisandrol B， schisantherin A， schisantherin B， deoxyschizandrin， γ-schizandrin， pseudo-γ-schizandrin. The results of cluster analysis showed that 15 batches of wine-processed S. chinensis could be clustered into 4 categories. Among them， S1-S4 and S14 were clustered into one category， S9-S11 were clustered into one category， S5， S7-S8， S12-S13 were clustered into one category， and S6 and S15 were clustered into one category. The results of principal component analysis showed that the cumulative variance contribution rate of first four principal components was 85.381%; the classification results were basically consistent with the results of cluster analysis. Compared with S. chinensis， 5-hydroxymethyl furfural was newly found in S. chinensis after wine-processing， with high content; but there was no significant difference in the other chromatographic peaks. CONCLUSIONS： The established HPLC fingerprint is simple and easy to operate， combined with cluster analysis and principal component analysis， can be used for quality control of wine-processed S. chinensis decoction pieces.

KEYWORDS Wine-processed Schisandra chinensis; HPLC; Fingerprint; Cluster analysis; Principal component analysis

基金项目：山西省重点研发计划重点项目（No.201603D31140-10）;山西省实验动物专项资金项目（No.2015K06）;山西省中药材、中药饮片地方标准研究项目（No.2014004B）

讲师，硕士。研究方向：中药药效物质及质量控制。电话：0351-3179979。E-mail：lihuifeng2046@163.com

通信作者：教授，硕士。研究方向：中药复方化学及新产品开发。电话：0351-3179979。E-mail：peimr602@163.com

酒五味子为五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.经黄酒蒸制而成的炮制加工品，最早记载于宋代《圣济总录》，曰“用酒三升浸三日取出焙干”[1]。五味子酒制旨在借酒行药势，增强其滋肾功效[2-3]。有研究指出，五味子主要含有木脂素类、三萜类、有机酸类、多糖类及挥发油等成分，其中五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酯甲等木脂素类化合物为其主要活性成分[4]，具有改善心肌缺血/再灌注引起的心肌损伤、心肌肥大、心肌氧化损伤和保肝护肝、调节中枢、增强免疫、改善肾功能、抗菌抑菌等作用[5]。目前，关于生五味子的指纹图谱研究较多[6-7]，也有通过建立指纹图谱区分南、北五味子并比较两者化学成分的研究[8];而关于酒五味子的研究则主要集中在补肾功效评价、酒制前后木脂素类成分含量变化等方面[9-11]。酒五味子饮片在临床及成方制剂中多有应用，如2020年版《中国药典》（一部）收载的人参养荣丸、健脑丸等[12]。酒五味子饮片虽被收载于《山东省中药饮片炮制规范（2012年版）》[13]和《安徽省中药饮片炮制规范（2019年版）》[14]中，但并未有指纹图谱的规定。因此，基于指纹图谱的质量控制研究有限，使得酒五味子饮片的整体质量无法得到全面评价，五味子酒制前后的成分差异未能被完全阐明，制约了酒五味子炮制机制及药效作用的深入研究。

中药指纹图谱具有重现性好、专属性强、稳定性好的特点，可全面系统地表征中药化学成分的特征[15]。化学模式识别分析能鉴别药材样品之间的差异，综合评估中药的质量[16-17]。基于此，本研究建立了酒五味子的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并结合聚类分析、主成分分析等对其质量进行评价，旨在为酒五味子的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有2695型HPLC仪及配备的2998型二极管阵列检测器、Empower 2色谱工作站（美国Waters公司），AB135-S型十万分之一电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，FA2104型万分之一电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司），SB-5200 DTDN型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

5-羟甲基糠醛对照品（批号111626-202013）、五味子醇甲对照品（批号110857-201815）、五味子酯甲对照品（批号111529-201706）均购自中国食品药品检定研究院，纯度均大于95%;五味子酯乙对照品（批号58546- 55-7，纯度97.2%）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司;五味子醇乙对照品（批号151113）、五味子甲素对照品（批号131111）、五味子乙素对照品（批号151113）、五味子丙素对照品（批号140617）均购自成都普菲德生物技术有限公司，纯度均大于98%;甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

15批五味子药材（编号Y1～Y15）均购自河北省某药材市场、山西省某中药饮片公司或北京同仁堂药店，经山西中医药大学中药鉴定教研室裴香萍副教授鉴定均为木兰科植物五味子S. chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实。根据本课题组前期所得最优酒制工艺进行炮制：取净五味子药材1 kg，加黄酒200 g，拌匀，闷润30 min，置于罐或适宜容器内，密闭，隔水加热，蒸约2 h至酒尽，待药材颜色变黑时，取出，于60 ℃下干燥，即得酒五味子饮片（共15批，编号依次为S1～S15）。15批五味子药材来源信息见表1。

2 方法与结果

2.1 指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件以Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以甲醇（A）-水（B）为流动相进行梯度洗脱（0～8 min，5%A→10%A;8～25 min，10%A→60%A;25～55 min，60%A→68%A;55～64 min，68%A→70%A;64～90 min，70%A→80%A;90～93 min，80%A;93～94 min，80%A→5%A）;检测波长为250 nm;流速为1 mL/min;柱温为30 ℃;进样量为10 μL。

2.1.2 供试品溶液的制备取酒五味子饮片粉末（过四号筛，下同）约1 g，精密称定，置于25 mL锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz，下同）处理30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 混合对照品溶液的制备分别取5-羟甲基糠醛、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素对照品0.98、3.44、0.91、1.24、1.03、0.71、0.93、0.38 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇适量，超聲使其完全溶解，冷却，用甲醇定容，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得混合对照品溶液。

2.1.4 精密度试验取“2.1.2”项下供试品溶液（编号S1），按“2.1.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图，以五味子醇甲为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，20个共有峰相对保留时间的RSD为0.03%～0.96%（n=6），相对峰面积的RSD为0.95%～2.00%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.5 稳定性试验取“2.1.2”项下供试品溶液（编号S1），分别于室温下放置0、3、6、9、12、15 h时按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以五味子醇甲为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，20个共有峰相对保留时间的RSD为0.02%～0.97%（n=6），相对峰面积的RSD为0.59%～1.99%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置15 h内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验取酒五味子饮片（编号S1）粉末，共6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以五味子醇甲为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，20个共有峰相对保留时间的RSD为0.02%～0.56%（n=6），相对峰面积的RSD为0.89%～2.06%（n=6），表明方法重复性良好。

2.1.7 指纹图谱的建立及对照指纹图谱的生成取15批酒五味子饮片粉末，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》对所得酒五味子的色谱图进行分析，以分离度较好的S1为参照图谱，采用中位数法生成叠加指纹图谱和对照指纹图谱。结果显示，15批酒五味子饮片共有20个共有峰。酒五味子饮片的HPLC叠加指纹图谱见图1，对照指纹图谱见图2。

2.1.8 共有峰的指认取 “2.1.3”项下混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图（图3）。将15批酒五味子饮片的HPLC叠加指纹图谱与上述混合对照品溶液色谱图进行对比，共指认了其中8个共有峰，分別为5-羟甲基糠醛（峰1）、五味子醇甲（峰2）、五味子醇乙（峰5）、五味子酯甲（峰9）、五味子酯乙（峰10）、五味子甲素（峰13）、五味子乙素（峰18）、五味子丙素（峰20）。由于五味子醇甲（峰2）的峰面积较大、出峰时间居中、峰形好，且与相邻色谱峰分离较好，故选择五味子醇甲为参照峰。

2.1.9 相似度评价以酒五味子饮片的对照指纹图谱为参照，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》进行相似度评价。结果显示，15批酒五味子饮片指纹图谱的相似度均大于0.98。结果见表2。

2.2 聚类分析

以15批酒五味子饮片指纹图谱中20个共有峰的相对峰面积为变量，利用SPSS 22.0软件，运用Ward法以平方Euclidean距离为测度进行聚类分析。结果显示，当距离为20时，15批酒五味子饮片可聚为两类，其中S1～S4、S14聚为一类，其药材生品的产地均为河北;S5～S13、S15聚为一类，其药材生品的产地为东北地区（黑龙江、吉林和辽宁）。当距离为6时，15批酒五味子饮片可聚为3类，其中S1～S4、S14聚为一类，其药材生品的产地均为河北;S5、S7～13聚为一类，其药材生品的产地为黑龙江和吉林;S6、S15聚为一类，其药材生品的产地均为辽宁。当距离为4时，可进一步将S5、S7～13分为两类，其中S9～S11聚为一类，其药材生品的产地为黑龙江;S5、S7～S8、S12～S13聚为一类，其药材生品的产地均为吉林。以上结果提示，不同产地酒五味子饮片的化学成分存在差异。结果见图4。

2.3 主成分分析

利用SPSS 22.0软件，将15批酒五味子饮片指纹图谱中20个共有峰的相对峰面积进行标准化处理，再通过主成分法进行因子分析。总方差解释结果显示，共有4个主成分的特征值大于1，方差贡献率分别为47.031%、15.546%、13.743%、9.061%，累计方差贡献率为85.381%。结果见表3。

以15批酒五味子饮片指纹图谱中20个共有峰的相对峰面积为变量，利用SPSS 22.0软件绘制碎石图，详见图5。由图5可知，前4个主成分之间的坡度较陡，其余主成分之间的坡度较缓，表明这20个主成分中，前4个主成分具有主导作用。

以15批酒五味子饮片指纹图谱中20个共有峰的相对峰面积为变量，利用SPSS 22.0软件进行成分矩阵分析，详见表4。由表4可知，第1主成分主要反映峰1～3、5～6、8、10、12～17、19对应成分的信息，其中峰1为5-羟甲基糠醛、峰2为五味子醇甲、峰5为五味子醇乙、峰10为五味子酯乙、峰13为五味子甲素，其余峰未知;第2主成分主要反映峰7、9、11对应成分的信息，其中峰9为五味子酯甲，其余峰未知;第3主成分主要反映峰18、20对应成分的信息，其中峰18为五味子乙素、峰20为五味子丙素;第4主成分主要反映峰4对应成分的信息，该峰未知。这表明通过因子分析降维处理后所提取的4个主成分能代表酒五味子饮片指纹图谱中20个共有峰的主要信息（因第4主成分反映的峰信息未知且数量少，故仅对前3个主成分进行后续散点图分析）。

由表3中的特征值和表4中的成分矩阵结果计算主成分载荷矩阵（U）：Ui=Ai/[√λi] （式中，λ为特征值，A为成分矩阵，i=1～3）。将酒五味子饮片指纹图谱中20个共有峰的相对峰面积进行标准化处理得到X1～X20，根据U1、U2、U3和X1～X20计算主成分得分（Y）：Y1=U1（1）X1+U1（2）X2+……+ U1（20）X20;Y2=U2（1）X1+U2（2）X2+……+U2（20）X20;Y3=U3（1）X1+ U3（2）X2+……+U3（20）X20。以第1、第2、第3主成分的因子得分（Y1、Y2、Y3）为变量，利用SPSS 22.0软件绘制15批酒五味子饮片的散点图（空间中距离较近的为同类样本[18]），详见图6。由图6可知，S1～S4、S14为一类，S5～S13、S15为一类;按照其在空间中的分散程度分析可知，S9～S11为一小类，S5、S7～S8、S12～S13为一小类，S6、S15为一小类，但S6和S15在空间中相对分散，可能是由饮片生产企业工艺不同或药材采收时间差异所致。该结果与聚类分析结果基本相同。

2.4 五味子酒制前后的HPLC图对比

精密称取生五味子（编号Y1）及酒五味子饮片（编号S1）粉末，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，与生五味子比较，酒制后的五味子中新增了5-羟甲基糠醛，且含量较高，而其余色谱峰未见明显差异。结果见图7。

3 讨论

本课题组前期在200～400 nm波长范围内进行了全波长扫描，并分别比较了283、250、210 nm波长下指纹图谱中各色谱峰的出峰情况。结果显示，于283 nm波长下，5-羟甲基糠醛色谱峰的响应最强，其余色谱峰的响应较弱;于210 nm波长下，色谱图的基线噪音较大;于250 nm波长下，所得指纹图谱的色谱信息较全面，基线较平稳，故选择250 nm为检测波长。同时，本课题组前期分别对不同色谱柱[Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Brava BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Apollo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]进行了考察。结果发现，以Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱时，酒五味子中各色譜峰分离良好，而采用另外两种色谱柱时，峰3～7未达到完全分离，分离效果欠佳，故选择Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱。

15批酒五味子饮片指纹图谱的相似度均大于0.98，表明不同批次酒五味子饮片之间成分差异较小，相似性良好。聚类分析结果显示，当距离为4时，15批酒五味子饮片样品可聚为4类，其中河北产样品S1～S4、S14聚为一类，黑龙江产样品S9～S11聚为一类，吉林产样品S5、S7～S8、S12～S13聚为一类，辽宁产样品S6、S15聚为一类，表明聚类分析可以区分不同产地的酒五味子样品。主成分分析结果显示，前4个主成分的累计方差贡献率为85.381%;15批酒五味子饮片分为4类，与聚类分析结果基本相同。本研究采用中药指纹图谱相似度评价和聚类分析、主成分分析等化学模式识别分析对15批酒五味子饮片的质量进行了评价，所得结果基本一致，可为酒五味子饮片的质量控制提供参考。

有研究发现，生五味子在炮制、煎煮或长时间放置过程中，其所含葡萄糖等单糖化合物在高温环境下可转化为5-羟甲基糠醛[19]。5-羟甲基糠醛是一种具有毒性的活性成分：一方面，其具有抗氧化、改善学习记忆、抗心肌缺血的作用;另一方面，该成分又具有神经毒性，可致横纹肌麻痹和内脏损害[20-21]。本研究结果显示，生五味子中不含5-羟甲基糠醛;而经酒制后，酒五味子中的5-羟甲基糠醛（峰1）含量显著增加，而其余色谱峰未见明显差异。因此，笔者认为，5-羟甲基糠醛含量可作为酒五味子饮片炮制工艺以及质量控制的关键参数。《本草纲目》记载，五味子“入补药熟用”[22]。现代研究发现，酒五味子补肾作用最好[9-10]，但5-羟甲基糠醛是否为酒五味子补肾作用的有效成分，且该成分是否会影响酒五味子应用的安全性，尚待后续研究进一步探讨。

综上所述，所建HPLC指纹图谱简便、易行，结合聚类分析和主成分分析可用于酒五味子饮片的质量控制。

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