UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS分析 头痛宁胶囊的体内分布特征

宗时宇，刘洋，狄志彪，刘峰，张红*（.陕西省中医药研究院，西安 70003；.陕西步长制药有限公司，西安 70075）

头痛宁胶囊是由陕西步长制药有限公司研制和独家生产的中药复方制剂，是以清代医学家孟元瑞的“立愈汤”（天麻、土茯苓、制何首乌、当归、防风）加用全蝎共6味中药制成，具有涤痰熄风、镇痛逐瘀的功效[1-2]。头痛宁胶囊在临床用于治疗各种头痛，尤其针对原发性偏头痛和紧张性头痛痰瘀阻络证具有良好的疗效和安全性[3-5]，是我国第一个能够解除头痛（偏头痛、紧张型头痛）的具有独立知识产权的创新中成药，2009年被国家科技部认定为“国家重点新产品”[6]。虽然头痛宁胶囊的有效性和安全性已得到临床验证，但其药效物质基础仍不明确。

目前对头痛宁胶囊化学成分的研究多停留在单味药材。方中君药天麻是一种名贵中药材，对于偏头痛、高血压和失眠等具有良好的治疗效果，主要含有酚类、有机酸类、多糖类及甾体类等化学成分[7]。土茯苓具有解毒利湿、凉血解毒、祛风止痛的功效，含有糖类、有机酸类、苯丙素类、黄酮和黄酮苷类、甾醇类、皂苷类及挥发油等多种化学成分[8]。制何首乌的药效成分主要为二苯乙烯苷类、蒽醌类以及黄酮类[9]。当归主要含有挥发油、有机酸、多糖和黄酮等成分[10]。防风的主要活性成分包括色原酮、香豆素、挥发油等[11]。全蝎中含蝎毒、生物碱及甾体衍生物等小分子成分[12]。有关头痛宁胶囊体内效应物质的系统性研究还未见报道。

中药多成分药代动力学可通过揭示中药成分能否被机体有效利用来帮助发现可成为药效物质基础的中药成分[13]。因此，本课题组借助UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS分析手段，开展了头痛宁胶囊在大鼠体内的分布特征研究，以期为揭示其潜在的药效物质基础提供科学依据和参考。

1 材料

1.1 仪器

Ultimate 3000型超高效液相色谱系统和Q Exactive Focus型 质 谱 仪（美 国Thermo Fisher Scientific公司）；TL2010S型中通量组织研磨仪（北京鼎昊源科技有限公司）；NX-1R型冷冻型高速台式离心机[鼎昊源（天津）科技有限公司]；YGC-36型氮吹仪（郑州宝晶电子科技有限公司）；SQP型电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，d＝0.1 mg]；XM-P22H型无级调功超声波清洗机[小美超声仪器（昆山）有限公司]。

1.2 试药

头痛宁胶囊（批号：190317，陕西步长制药有限公司，规格：0.4 g/粒）；肝素钠注射液（医用，上海国药集团化学试剂有限公司）；甲醇为色谱级，甲酸为质谱级（美国Thermo Fisher Scientific公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.3 动物

健康雄性SD大鼠12只，体质量260～280 g，购于西安交通大学医学部动物实验中心，许可证号：SCXK（陕）2018-001。

2 方法

2.1 给药方案

大鼠随机分为空白对照组和给药组，每组6只。空白对照组灌胃给予纯净水，给药组按照预实验探索的最大给药浓度0.56 g·mL－1，以大鼠体质量10 mL·kg－1的剂量（约为60 kg成人等效剂量的15倍）灌胃给予头痛宁胶囊内容物水溶液，每日给药1次，连续4 d。并于第4日给药前所有大鼠禁食不禁水12 h。

2.2 血浆样品收集与处理

分别于第4日灌胃给药后15、30、60、90、120 min，采取大鼠眼眶静脉丛血约0.3 mL，置于加有抗凝剂1%肝素钠溶液的EP管，离心（4000 r·min－1，10 min），取上层血浆100 μL，置于1.5 mL EP管中，加入200 μL甲醇，涡旋混匀，离心（13 000 r·min－1，10 min），分离上清，氮气吹干，残渣加入50 μL甲醇复溶，离心（13 000 r·min－1，10 min），取上清液进行分析。

2.3 组织样品收集与处理

取完血样，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉后，进行心脏灌注，取出心、肝、脾、肺、肾、脑等组织，用生理盐水快速清洗，吸干水分后称重，并用等量的生理盐水进行匀浆，离心（13 000 r·min－1，10 min），分离上清，按 1∶3 比例加入沉淀剂甲醇，涡旋混匀，离心（13 000 r·min－1，10 min），取上清液过0.22 μm微孔滤膜过滤进行分析。

2.4 排泄物收集与处理

从第3日给药后8 h开始至第4日给药前，收集所有大鼠的尿粪排泄物。粪便用2倍量的生理盐水进行匀浆，离心（13 000 r·min－1，10 min），分离上清，按 1∶3 比例加入沉淀剂甲醇，涡旋混匀，离心（13 000 r·min－1，10 min），取上清液过0.22 μm微孔滤膜过滤进行分析。

2.5 色谱和质谱条件

2.5.1 色谱条件 Thermo Accucore aQ C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm），流速0.3 mL·min－1，进样量5 μL，柱温30℃。流动相采用甲醇（A）和0.1%甲酸水（B）梯度洗脱，洗脱程序为0～10 min，5%～25%A；10～25 min，25%～60%A；25～30 min，60%A；30～35 min，60%～95%A。

2.5.2 质谱条件 离子源为加热电喷雾离子源（H-ESI），喷雾电压3.5 kV，鞘气（N2）流量 40 arb，辅助气流量10 arb，辅助加热器温度350℃，毛细管温度320℃，S-lens射频水平50，自动增益控制（AGC）106。扫描方式采用正、负离子Full MS/dd-MS2模式，Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率35 000；扫描范围m/z80～1200，碰撞能量30 eV。

2.6 数据处理

利用UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS，在“2.5”项条件下，对所有样品进行数据采集。根据质谱精确相对分子量信息，选择一级准分子离子峰质荷比实测值与理论值误差小于5的分子与自建的头痛宁胶囊化学成分数据库信息进行匹配，推测化学成分信息。

3 结果

3.1 入血化学成分

从给药后15、30、60、90、120 min的大鼠血浆样品中分别检出39、44、42、41、38种头痛宁胶囊的原形成分。由此可见，在给药后30 min，大鼠体内入血的化学成分最多，共有44种（见表1），包括以升麻素、升麻素苷、落新妇苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、亥茅酚及亥茅酚苷等为代表的14种黄酮类成分，以油酸、亚油酸等为代表的11种有机酸类成分，以天麻素为代表的5种酚类成分，以2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和白藜芦醇为代表的2种二苯乙烯苷类成分，以及如蒽醌、香豆素等12种其他类成分。头痛宁胶囊的入血原形成分主要来源于药材制何首乌和当归，其次为天麻和防风，类型以黄酮类化合物居多。

表1 头痛宁胶囊入血原形成分 Tab 1 Prototype composition of Toutongning capsule into blood

续表1

3.2 组织分布

大鼠脑组织中检测到升麻素、大黄酚、白藜芦醇和溶血磷脂酰胆碱等8种头痛宁胶囊的原形成分，这些成分主要来源于药材制何首乌。大鼠的心、肝、脾、肺、肾组织中分别检测到7、9、20、4、11种头痛宁胶囊的原形成分。表明原形成分在脾脏的分布最广泛，其次为肾脏、肝脏，在肺组织的分布最少。此外，实验发现所有组织中均检测到了升麻素。详细结果见表2。

3.3 排泄物化学成分

大鼠的粪便和尿液中各检出21种头痛宁胶囊的原形成分（见表2），主要为黄酮类、有机酸类及酚类成分。粪便中检测出的化学成分多来源于药材土茯苓、制何首乌和当归，尿样中的成分多来源于药材天麻、制何首乌和当归。

表2 头痛宁胶囊在组织和排泄物中的原形成分分布 Tab 2 Distribution of prototype components in tissues and excreta of Toutongning capsule

续表2

4 讨论

该实验采用UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS技术，在正、负离子同时扫描模式下，对大鼠给药后不同时间点的血浆、重要脏器组织和排泄物样品进行分析。实验结果发现给药后30 min，大鼠体内入血的化学成分最多，共检测到44种头痛宁胶囊的原形成分；排泄物中检出21种；脑组织中检测到8种；心、肝、脾、肺、肾组织中分别检测到7、9、20、4、11种，在脾、肾、肝组织中有较高的暴露量，这可能是因方中诸药多入肝、脾、肾经的缘故。所检出的化学成分主要来源于药材制何首乌、当归、天麻和防风，类型以黄酮类、有机酸、酚类及二苯乙烯苷类化合物为主。黄酮类成分主要有升麻素、升麻素苷、落新妇苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚及亥茅酚苷等；酚类成分代表为天麻素；二苯乙烯苷类成分有2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和白藜芦醇。

落新妇苷、2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、天麻素和升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷分别是药材土茯苓、制何首乌、天麻和防风的质控指标成分[16]。姜华等[17]研究表明，防风中升麻素具有较强的镇痛、抗炎作用，且作用迅速；升麻素苷也具有相应的药理活性，但作用迟缓，效果不及升麻素。聂西周等[18]采用系统药理学方法对头痛宁胶囊治疗偏头痛的TNF通路进行研究发现，来源于药材制何首乌的成分白藜芦醇在治疗偏头痛的TNF机制中发挥至关重要的作用。另有研究[19]显示，头痛宁胶囊可通过降低患者血浆溶血磷脂酸及血液流变学水平，从而缓解偏头痛。该实验在大鼠脑组织中检测到了来源于药材制何首乌的原形成分溶血磷脂酰胆碱，因而我们推测头痛宁胶囊可能是通过其成分溶血磷脂酰胆碱与血浆中溶血磷脂酸结合，从而降低了血浆中游离溶血磷脂酸的水平。

本实验通过头痛宁胶囊在大鼠体内的分布特征研究，检测分析得到的升麻素、升麻素苷、白藜芦醇、溶血磷脂酰胆碱、天麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、落新妇苷和2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷等成分，可为头痛宁胶囊药效物质基础的研究及药效标志物的筛选提供依据和参考。