炒酸枣仁对地西泮诱导的睡眠及宿醉效应的影响

叶晓楠，向甜甜，王艳艳，黄莉莉，华伊，吴传芳，李廷利*（.黑龙江中医药大学，哈尔滨 50040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 50040）

随着生活节奏的加快，失眠的患病率也在逐年攀升。在我国，符合失眠症诊断标准的患者约占15%[1]，严重失眠的患者其病程可达十年之久[2]。目前，药物治疗是临床上治疗失眠的主要方法之一，一线药物以具有镇静催眠作用的化学药物为主，根据化学结构和受体作用位点的不同，镇静催眠药可分为巴比妥类、苯二氮䓬类、非苯二氮䓬类、褪黑素受体激动剂以及一些具有催眠效果的抗组胺药、抗抑郁药等。苯二氮䓬类药物短期对症疗效确切，但用药后常伴有嗜睡、头昏以及反跳性失眠等不良反应，大剂量使用可见共济失调，长期应用还会出现认知障碍、甚至是蓄积中毒，因此人们迫切希望有更加安全有效的药物或是对现有药物具有增效减毒作用的药物出现。

宿醉是指服用传统镇静催眠药（苯二氮䓬类）次日出现的头晕、困倦、精神不振等现象[3]，系由药物半衰期长、在体内代谢缓慢所致。研究表明，合理配伍中药可以有效降低宿醉反应[4-5]。酸枣仁是鼠李科植物酸枣Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子[6]，始记载于《神农本草经》，医籍初见于《伤寒杂病论》[7]。其味甘、酸，平，归肝、胆、心经，具有养心补肝、宁心安神、敛汗、生津之功。研究发现，酸枣仁中具有生物活性的物质高达50多种[8]，近些年来有关于酸枣仁改善睡眠的研究较为深入，其中已经明确皂苷类、生物碱类和黄酮类物质具有改善睡眠的作用[9]，其作用机制可能与调节细胞因子[10]、单胺类神经递质、氨基酸类神经递质水平有关[11]，但是目前在中西医结合领域关于酸枣仁是否具有协同增强传统镇静催眠类药物的催眠作用以及是否能降低该类药物不良反应的研究鲜有报道。因此本文针对上述问题，选择了临床常用的苯二氮䓬类长半衰期药物地西泮来研究酸枣仁对其增效减毒作用，为丰富酸枣仁的临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级雄性ICR小鼠，体质量（20±2）g [黑龙江中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK（黑）2013-004]。饲养在温度（24±2）℃，湿度50%～60%，12 h明暗交替（光照时间7：00～19：00，光照强度300 Lux）的环境中，适应性喂养7 d，期间自由摄取食物和水。

1.2 试药

酸枣仁[山西振东道地药材开发有限公司，由黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子]。地西泮注射液（天津金耀药业有限公司，批号：1605291，规格：10 mg/2 mL）。

1.3 仪器

ME204电子分析天平（上海梅特勒-托利多）；ZZ-6型小鼠自主活动测试仪（上海益联医学仪器发展有限公司）；小鼠高架十字迷宫（自制。黑色木质；中央平台：5 cm×5 cm；臂长×宽：30 cm×5 cm；闭臂高度：15 cm）。

2 方法

2.1 炒酸枣仁冻干粉的制备

参照耿欣等[12]优化的方法进行酸枣仁的炮制。将炮制后的230 g酸枣仁粉碎，取适量粗粉加入8倍量的蒸馏水，浸泡30 min，加热至沸腾后煎煮80 min，16层纱布过滤，冷冻干燥，得冻干粉30 g，密封保存。使用前取炒枣仁冻干粉26 g，加蒸馏水溶解，定容至50 mL，即得相当于生药量4 g·mL－1的炒酸枣仁冻干粉溶液。

2.2 地西泮诱导小鼠睡眠的最小有效剂量的研究

选取120只雄性ICR小鼠随机分为空白组和地西泮注射液不同剂量（5.2、10.4、15.6、20.8、41.6 mg·kg－1）组，每组20只。实验前所有动物禁食不禁水12 h，地西泮注射液组小鼠分别经腹腔注射给予相应剂量的地西泮注射液，空白组经腹腔注射给予等体积的0.9%NaCl溶液。注射后开始观察并计时，以小鼠翻正反射消失为指标，记录30 min内小鼠翻正反射消失达1 min以上的小鼠数量及小鼠睡眠时间（翻正反射消失的持续时间），并计算入睡率，入睡率（%）＝入睡小鼠数量/该组小鼠总数×100%。

2.3 炒酸枣仁对地西泮催眠的协同作用的研究

选取36只雄性ICR小鼠，随机分为空白组、地西泮组和炒酸枣仁联合地西泮组，每组12只。炒酸枣仁联合地西泮组小鼠经灌胃途径给予炒酸枣仁80 g·kg－1[4]，空白组和地西泮组给予同体积蒸馏水，每日1次，连续给药7 d，末次给药前禁食不禁水12 h，末次给药后30 min，地西泮组和炒酸枣仁联合地西泮组经腹腔注射地西泮注射液20.8 mg·kg－1，空白组注射等体积的0.9%NaCl溶液。观察记录小鼠的睡眠潜伏期和睡眠持续时间。

2.4 炒酸枣仁对地西泮宿醉效应的影响

2.4.1 小鼠自主活动实验 在翻正反射恢复30 min后，将“2.3”项下的小鼠放入小鼠自主活动测量仪，先在仪器内适应环境5 min，记录随后5 min内的小鼠站立次数和活动次数。实验结束后，用醋酸水溶液擦拭箱体，以消除上只动物的气味对后续实验动物的影响。

2.4.2 小鼠高架十字迷宫实验 在完成自主活动实验测试后5 min，将小鼠头朝一侧开臂，放入高架十字迷宫中央区，让小鼠自由探索迷宫5 min，实验结束后，用醋酸水溶液擦拭迷宫，以消除上只动物的气味对后续实验动物的影响。通过视频记录分析5 min内小鼠开放臂停留时间、开放臂进入次数、闭臂停留时间、闭臂进入次数。

2.5 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学处理，计数资料采用χ2和Fisher精确检验。计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，用LSD法进行两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 地西泮诱导小鼠睡眠的最小有效剂量

在睡眠时间上，与空白组相比，地西泮10.4、15.6、20.8、41.6 mg·kg－1组小鼠的睡眠时间明显增加（P＜0.01）；在入睡率上，地西泮5.2 mg·kg－1组小鼠未进入睡眠，但观察显示小鼠活动明显减少；地西泮10.4 mg·kg－1组小鼠仅有个别动物进入睡眠；与空白组比较，地西泮15.6、20.8和41.6 mg·kg－1组的小鼠入睡率均增加（P＜0.01），在20.8 mg·kg－1小鼠入睡率达到100%，因此在本研究后续实验中采用20.8 mg·kg－1的地西泮诱导小鼠睡眠。实验结果见图1。

图1 地西泮诱导小鼠睡眠的最小有效剂量的研究 Fig 1 Minimum effective dose of diazepam on sedative and hypnotic effect in mice

3.2 炒酸枣仁对地西泮催眠的协同作用

与地西泮组小鼠相比，炒酸枣仁联合地西泮组小鼠的睡眠持续时间增加（P＜0.05），睡眠潜伏期未见明显变化（P＞0.05）。结果见表1。

表1 炒酸枣仁对地西泮催眠小鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间的影响(±s，n＝20) Tab 1 Effect of fried Semen Ziziphi spinosae on sleep latency and sleep duration of mice induced by diazepam (±s，n＝20)

表1 炒酸枣仁对地西泮催眠小鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间的影响(±s，n＝20) Tab 1 Effect of fried Semen Ziziphi spinosae on sleep latency and sleep duration of mice induced by diazepam (±s，n＝20)

注（Note）：与地西泮组比较，#P＜0.05（Compared with the diazepam group，#P＜0.05）。

组别 睡眠潜伏期/min 睡眠持续时间/min空白组 － －地西泮组 2.46±1.25 67.57±18.73炒酸枣仁联合地西泮组 2.37±0.67 83.17±18.68#

3.3 炒酸枣仁对地西泮所致宿醉效应的影响

3.3.1 小鼠自主活动实验结果 与空白组相比，地西泮组小鼠自主活动次数、站立次数均减少（P＜0.01）。与地西泮组相比，炒酸枣仁联合地西泮组小鼠的自主活动次数、站立次数均增加（P＜0.01）。实验结果见图2。

图2 炒酸枣仁对地西泮所致宿醉小鼠自主活动的影响Fig 2 Effect of fried Semen Ziziphi spinosae on locomotion activity of diazepam-induced hangover in mice

3.3.2 小鼠高架十字迷宫实验结果 与空白组相比，地西泮组与炒酸枣仁联合地西泮组小鼠开放臂停留时间明显增多（P＜0.01），在闭臂停留时间及闭臂进入次数明显减少（P＜0.01），与地西泮组相比，炒酸枣仁联合地西泮组小鼠在开放臂进入次数及闭臂进入次数明显增多（P＜0.01，P＜0.05）。实验结果见图3。

图3 炒酸枣仁对地西泮所致宿醉小鼠在高架十字迷宫行为的影响Fig 3 Effect of fried Semen Ziziphi spinosae on EPM behavior of diazepam-induced hangover in mice

4 讨论

失眠症的治疗方法主要包括心理治疗、药物治疗和物理治疗[13]，苯二氮䓬受体激动剂是药物疗法的首选药物，该类药物短期应用疗效确切，但不良反应较多。宿醉效应是地西泮最常见的不良反应之一[14-15]，是指患者在服药次日晨起出现的头晕、困倦、精神不振，如同“醉酒醒来”的现象，严重影响了患者日间的工作效率和正常生活。研究表明，宿醉的发生主要和药物半衰期有关，而遗传因素、年龄和性别因素、妊娠因素及药物的协同作用因素[16]均可对药物在体内的清除速率产生影响。酸枣仁为安神类中药临床应用的首选，其用于改善睡眠从汉末便有记载[17]。自宋代有了酸枣仁炮制品开始，出现了酸枣仁“生熟异治”的药效之说，宋《太平圣惠方》载“胆虚不眠寒也，酸枣仁炒香”[18]；明《本草纲目》曰“睡多生使，不得睡炒熟”[19]，考证医学古籍发现生酸枣仁与炒酸枣仁的功效存在差异，治疗“失眠”多用炒品[20-21]，且炮制领域一直有着“逢子必炒”[22]的理论，因此本文使用的是炒酸枣仁。近代也有许多学者围绕酸枣仁开展了主要化学成分的研究[23]，和其对改善睡眠的作用[24]及作用机制[25-26]进行的药理学研究，但对于酸枣仁联合地西泮使用治疗失眠的作用如何，尚未明确。

本研究围绕上述问题，首先开展了地西泮诱导小鼠睡眠的最小有效剂量的研究，剂量选择的依据是参照地西泮治疗失眠的人用推荐剂量，根据体表面积进行折算[27]，求得小鼠的使用剂量为每日1.3～6.5 mg·kg－1，在预实验中，地西泮在2.5 mg·kg－1时，小鼠未出现翻正反射消失的现象，因此在该实验中设置5.2 mg·kg－1为初始浓度，结果表明，当地西泮使用剂量达到20.8 mg·kg－1时，与空白组小鼠相比，地西泮组小鼠睡眠时间显著延长，且入睡率达到100%，因此后续实验均在该剂量下进行。

在课题组前期的炒酸枣仁改善小鼠睡眠作用的量效关系实验中发现，炒酸枣仁在20～80 g·kg－1的剂量范围内，其改善睡眠的作用呈现剂量依赖关系，当剂量达到80 g·kg－1时，其改善睡眠的作用最佳[4]，故在本研究中，采用其改善睡眠作用的最佳剂量作为给药剂量，探讨其对地西泮所致的睡眠及宿醉效应的影响。本研究发现，炒酸枣仁可以延长地西泮所致小鼠睡眠持续时间，但是对地西泮所致睡眠的入睡潜伏期无影响，说明炒酸枣仁对地西泮所致的睡眠具有协同增效的作用。在炒酸枣仁对地西泮所致宿醉效应的影响实验中，发现炒酸枣仁可使给予地西泮的小鼠自主活动次数和站立次数增多，而在高架十字迷宫实验，因为地西泮和炒酸枣仁均具有抗焦虑[28-30]的作用，因此单独给予地西泮以及炒酸枣仁联合地西泮应用均表现出一定的抗焦虑的作用，炒酸枣仁联合地西泮组小鼠的开放臂进入次数以及闭臂进入次数增多，反映了炒酸枣仁可使给予地西泮的小鼠自主活动能力增强。

本研究结果显示炒酸枣仁与地西泮联合使用可以减轻地西泮的宿醉效应，主要表现为增强小鼠的自主活动能力，减轻对小鼠清醒后的持续抑制状态。综上所述，炒酸枣仁对地西泮具有一定的“增效减毒”的作用，该作用可能与影响地西泮的体内代谢过程有关，其详细作用机制还需要进一步研究。