HPLC 同步检测肥猪散中儿茶素、间苯三酚、二苯乙烯苷三种活性成分的研究
2021-12-30胡昭伟王宏军单文琪
姚 丹 , 胡昭伟 , 王宏军 , 单文琪 , 王 培
(1.锦州医科大学畜牧兽医学院,辽宁锦州121001;2.锦州市北山农垦有限责任公司,辽宁锦州121000)
肥猪散源自《中国兽药典》(2020 版),由黄豆与麦芽、制何首乌、绵马贯众三味中草药组成,具有消食开胃、促长催肥、导滞驱虫的作用。 闫立志(2018)用HPLC 检测分析了肥猪散醇提物中的间苯三酚、二苯乙烯苷的含量,且证明该提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较好的抗菌活性;单乃荣等(2017)建立了肥猪散中制何首乌的薄层色谱(TLC)定性鉴别法;郭芳茹等(2015)研究表明,肥猪散发酵制剂能够增加消化不良家兔模型的体重和进食量,调整胃酸量和胃蛋白酶的活性;郭芳茹等(2016)采用固态发酵法优化肥猪散发酵制剂最佳发酵工艺, 获得最适宜的发酵菌株为纳豆芽孢杆菌,且游离大豆异黄酮含量高。目前鲜见对该组方中其他成分的HPLC 检测。鉴于此,本实验以50%乙醇为提取溶剂, 建立了HPLC 同步测定肥猪散中 2,3,5,4-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷、(+)-儿茶素、间苯三酚的方法。
1 材料与方法
1.1 主要仪器 高效液相色谱仪:L-7420(日本日立公司),配四联泵、脱气泵、紫外检测器和柱温箱;色谱柱:岛津 InertSustian C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)(天津市尚亚科技发展有限公司);旋转蒸发仪:RE-5203 型(上海亚荣生化仪器厂);超声波清洗器:KQ-300B(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2 主要试剂 乙醇(分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司);甲醇(色谱纯,天津市津东天正精细化学试剂厂);磷酸(分析纯,天津南开大学精细化工股份有限公司)。麦芽、制何首乌、绵马贯众,购自辽西国药店;黄豆购自市场;2,3,5,4-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷、(+)-儿茶素、 间苯三酚对照品,购自成都曼思特生物科技有限公司。
1.3 色谱条件 流动相:甲醇- 0.1%磷酸水梯度洗脱,有机相洗脱梯度为:0 ~ 10 min,10% ~ 30%甲醇;10 ~ 40 min,30% ~ 60%甲醇;40 ~ 50 min,60%甲醇;流速1.0 mL/min;柱温25 ℃;检测波长254 nm;进样量 10 μL。
1.4 样品处理 将制何首乌、绵马贯众、麦芽、黄豆分别粉碎,按照《中国兽药典》收载处方配比即制何首乌:绵马贯众:麦芽:黄豆=3:3:50:50,准确称量5 g,加入80 倍的 50%乙醇,回流提取4 h,提取3 次,合并提取液,减压浓缩,干燥即得肥猪散提取物;准确称取提取物0.1027 g,加8 mL 甲醇溶解,经0.45 μm 针头滤器过滤,即为待测样品溶液。
1.5 方法学考察
1.5.1 线性考察 将 2,3,5,4-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷对照品用甲醇稀释成0.5 ~ 2.5 mg/L 的系列工作标准液,将(+)-儿茶素、间苯三酚对照品用甲醇稀释成0.25 ~2.0 mg/L 的系列工作标准液,进行液相色谱分析。 每个浓度重复测定3 次,取平均值绘制色谱峰面积-浓度标准曲线。
1.5.2 加样回收率 精密称取肥猪散提取物粉末6 份,每份2.5 mg,置于 5mL 容量瓶中,分别加入一定体积的2,3,5,4-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷、(+)-儿茶素、间苯三酚对照品溶液,按1.4 中制得待测样品溶液,按1.3 中的色谱条件进样10 μL,记录各组分峰面积,分别计算各组分RSD 值。
2 结果与分析
2.1 色谱分离 由图1 可知, 在优化的色谱分离条件下,间苯三酚、(+)-儿茶素、2,3,5,4-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷获得了良好的分离,且3 种化合物的保留时间分别为 6.398、14.398、26.065 min。
图1 样品和对照品HPLC 色谱图
2.2 标准曲线 将对照品系列浓度分别进样检测,以色谱峰面积(S)和对照品浓度(C,mg/L)作线性回归。 在 0.5 ~ 2.5 mg/L,2,3,5,4-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷标准曲线为S = 4×106C – 62986,R2=0.9968;在 0.25 ~ 2.0 mg/L,(+)-儿茶素的标准曲线为 S=2×106C-6375.7,R2=0.9957, 间苯三酚标准曲线为 S=1×106C-4350.3,R2=0.9937。
2.3 加样回收率 由表 1 可知,2,3,5,4-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷平均回收率为(98.84±1.92)%,RSD 值为 1.94%;(+)-儿茶素平均回收率为(99.60±1.13)%,RSD 值为 1.13%; 间苯三酚平均回收率为(97.40±1.59)%,RSD 值为 1.63%。
表1 加样回收率
2.4 精密度实验 应用上述建立的方法测定了在12 h 内不同时间段样品中二苯乙烯苷、 儿茶素、间苯三酚的含量,每个时间段重复进样5 次,6个时间段中 2,3,5,4-四羟基二苯乙烯葡萄苷、(+)-儿茶素、 间苯三酚含量的 RSD 值分别为1.17%、3.31%和2.30%,符合《中国兽药典》附录“兽用中草药质量标准分析方法验证指导原则”的规定,表明高效液相色谱仪精密度较好。
3 讨论
HPLC 检测分析中草药活性成分是目前最常用且最为方便的检测方法之一。 冯彦钦等(2015)分别采用UV 法和HPLC 法检测何首乌中二苯乙烯苷的含量,含量相差<1.4%。 本实验前期预实验也采用UV 法和HPLC 法检测提取物中的有效成分含量,结果分别为6.89%和5.95%,含量相差0.94%,表明两种方法用于肥猪散有效成分含量检测的结果均准确可靠,HPLC 法检测含量分辨率和重复性高;而UV 法简便、快速,适合样品的快速分析。 刘燕和晁若冰(2009)用 HPLC 检测出何首乌中具有两种不同的蒽醌类活性成分;刘钊等(2011)同样用HPLC 检测出绵马贯众中具有抗病毒作用的间苯三酚活性成分;但以上实验都是检测单味药中的活性成分,而本实验是以含有制何首乌、绵马贯众的肥猪散提取物作为检测对象,在优选的液相条件下,能够同步鉴定分析二苯乙烯苷、 间苯三酚及儿茶素三种成分,通过对线性、重复性、加样回收率的测定显示该方法基线稳定,重复性、线性关系良好,三种组分分离理想,回收率高,满足检测需求,表明建立的检测条件适用于肥猪散提取物相关活性成分的检测分析。 对于图谱中未标明的成分,可以用相同的提取条件对单味药进行提取,在同等色谱条件下对其进行成分检测,可以确定未标明成分的归属,有助于鉴定其化学成分,也可以通过HPLCMS 联用设备鉴定分离效果好的其他化合物。
4 结论
在检测波长为254 nm 条件下,以甲醇-0.1%磷酸水为流动相进行梯度洗脱, 可以同步检测到肥猪散提取物中间苯三酚、(+)-儿茶素、2,3,5,4-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷三种成分,该方法可以作为肥猪散上述主要活性成分含量检测的一种理想手段。