正交设计优化复方柴胡饲料添加剂的提取工艺

臧青民， 何玉妃， 章烨雯 ， 吕其壮， 卢成淑

（玉林师范学院生物与制药学院，广西玉林 537000）

中草药饲料添加剂是将中兽医理论结合于畜牧养殖，起到防治疾病、增强生产性能以及提高饲料品质作用的一类添加剂 （张新连，2019； 张亮，2017），具有天然、绿色的特点，兼具药物和营养的双重性（孙晓磊，2021；宿国强等，2021）。 目前，中草药饲料添加剂多为粗制品，即原料药粉碎、搅拌后直接添加在饲料中，这种方法投用量较大，不利于生产和运输（张志强等，2019；车清明，2012）。因此采用提纯、 精制等手段获得中草药中的有效成分， 加强提取工艺的研发， 成为近年的研究热点（夏诗琪等，2020；梁方方等，2019）。

复方柴胡饲料添加剂由柴胡等中草药组成。柴胡是伞形科植物柴胡（Bupleurum chinese DC.）的干燥根 （中国药典，2020）， 其含有多种活性成分，如皂苷、黄酮类、生物碱、木脂素、挥发油、多糖类、氨基酸等（辛国等，2018）。 柴胡皂苷为五环三萜类齐墩果烷型衍生物，具有良好的抗炎、抗病毒、抗细菌内毒素等作用 （吴红伟等，2020； 张耀峰，2020）。 其中，主要生物活性物质柴胡皂苷 a（SSa）、柴胡皂苷d （SSd） 是柴胡含量测定的指标性成分（尹鑫等，2018）。综上，本研究以 SSa、SSd 的转移率为指标，采用正交设计优化复方柴胡饲料添加剂的提取工艺，通过精制手段获得有效成分，以期为复方柴胡饲料添加剂在畜牧业的应用提供依据，也为中草药饲料添加剂的开发提供思路。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 高效液相色谱仪（LC-16AT，日本岛津国际贸易有限公司），电子天平（JA11002，上海皓庄仪器有限公司），高速粉碎机（FW135，天津市泰斯特仪器有限公司），数显恒温水浴锅（HH-2，常州国华电器有限公司）， 循环水式多用真空泵（SHZ-Ⅲ，郑州生化仪器有限公司）。

柴胡 （亳州市远光中草药饮片厂， 批号：1904074）， 经鉴定为伞形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）的干燥根。

SSa、SSd 购于上海华蓝化学科技有限公司；氨水、甲醇、无水乙醇等试剂均为分析纯；乙腈为色谱纯。

1.2 SSa、SSd 高效液相色谱含量测定方法学考察

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相见表 1；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

表1 高效液相色谱的流动相

1.2.2 供试品溶液的制备 称取复方柴胡最粗粉50 g，加10 倍量80%乙醇，回流提取1 h，得滤液，定容至1000 mL，摇匀，过滤。

1.2.3 对照品溶液的制备 精密称取SSa、SSd 对照品适量， 加甲醇溶解配制成每毫升含SSa、SSd各 0.2 mg 的溶液，摇匀，过滤。

1.2.4 空白样品溶液的制备 取80%乙醇溶液，摇匀，过滤。

1.2.5 专属性考察 按1.2.1 中条件下进样测定，结果表明，空白样品无干扰，SSa、SSd 色谱峰与其他色谱峰均达到基线分离（图1）。

图1 HPLC 专属性考察

1.2.6 线性关系考察 精密称取SSa、SSd 对照品各6 mg 置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释，摇匀，得储备液。分别精密量取一定量的储备液并配制成一系列浓度的溶液，按1.2.1 中条件进样测定，以峰面积为纵坐标，分别以SSa、SSd 质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.7 精密度考察 分别取SSa、SSd 对照品溶液，按1.2.1 中条件连续进样5 次，记录峰面积，计算 RSD。 SSa 的 RSD 为 0.34%，SSd 的 RSD 为0.35%，表明精密度良好。

1.2.8 稳定性考察 取供试品溶液，按1.2.1 中条件分别在 0、3、6、9、12、24 h 进样，记录峰面积，计算 RSD。 SSa 的 RSD 为 1.57%，SSd 的 RSD 为2.64%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

1.2.9 重复性考察 按1.2.2 中条件制备供试品溶液5 份，按1.2.1 中条件进样测定，记录峰面积，计算 RSD。 SSa 的 RSD 为 1.30%，SSd 的 RSD 为1.86%，表明制备方法重复性良好。

1.2.10 加样回收率考察 精密量取已知浓度的供试品溶液25 mL， 另精密加入接近SSa、SSd 浓度的对照品溶液25 mL，平行操作6 份，按1.2.1中条件下进样测定，记录峰面积，计算加样回收率和 RSD。 SSa 的平均回收率为 98.74%，RSD 为1.80%，SSd 的平均回收率为 102.45%，RSD 为2.93%，表明制备方法准确性良好。

1.3 单因素试验 以SSa、SSd 转移率为指标，分别设置乙醇浓度（60%、70%、80%、90%）、回流时间（30、60、90、120 min）和溶剂倍量（5、10、15、20）为考察因素和水平， 筛选出影响复方柴胡饲料添加剂提取的较优水平。

为将所有评价指标综合为一个能反映总体效果的值，本研究采用加权评分法处理数据，引入综合评价指标， 规定SSa、SSd 的权重系数分别为0.5、0.5。 各指标的试验数据则按以下方程进行处理：di=Yi/Ai， 其中 di 为各评价指标的评分值，Yi为各评价指标的实测值，Ai 为各评价指标中相应最大值（邓翀等，2011）。

1.4 正交试验 在单因素试验的基础上以SSa、SSd 转移率为考察指标，采用 L9（34）正交表安排试验，因素水平见表2。

表2 正交试验因素水平

1.5 数据处理与分析 采用SPSS 20.0 软件对正交试验数据进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制 分别以SSa、SSd 质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得线性回归方程y=3689.6x－1907.1，y=4208.20x+4663.10，结果见图2 和 图 3。 SSa、SSd 的 线 性 范 围 分 别 为 9.97 ～398.72 μg/mL（R2=0.9999）、10.04 ～ 401.60 μg/mL（R2=0.9999），线性关系良好。

图2 SSa 标准曲线

图3 SSd 标准曲线

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇浓度对复方柴胡提取的影响 本单因素试验固定回流时间60 min、溶剂倍量15，研究系列乙醇浓度对复方柴胡提取的影响， 结果见图4。随着乙醇浓度的增加，柴胡皂苷的转移率增大，其中80%乙醇与90%乙醇提取得到的转移率均较高且相近。

图4 乙醇浓度对柴胡皂苷转移率的影响

2.2.2 回流时间对复方柴胡提取的影响 本单因素试验固定乙醇浓度80%、溶剂倍量15，研究不同回流时间对复方柴胡提取的影响，结果见图5。在一定范围内，随着回流时间的增加，柴胡皂苷的转移率增大，但当回流时间超过60 min 时，由于SSa、SSd 结构不稳定， 长时间加热容易降解为次生苷，导致转移率降低。

图5 回流时间对柴胡皂苷转移率的影响

2.2.3 溶剂倍量对复方柴胡提取的影响 本单因素试验固定乙醇浓度80%、回流时间60 min，研究不同溶剂倍量对复方柴胡提取的影响，结果见图6。 随着溶剂倍量的增加，柴胡皂苷的转移率增大，当溶剂倍量超过15 时，转移率升高不明显。

图6 溶剂倍量对柴胡皂苷转移率的影响

2.3 正交试验结果

2.3.1 正交试验设计 正交试验设计及直观分析结果见表3。 由极差分析可知，回流时间对柴胡皂苷提取影响较大， 各因素主次顺序为回流时间>乙醇浓度>溶剂倍量，较优提取工艺为A3B2C3。

表3 复方柴胡正交试验设计及直观分析

2.3.2 方差分析 由表4 可知，回流时间（B）对皂苷转移率影响显著（P < 0.05），乙醇浓度（A）、溶剂倍量 （C） 对皂苷转移率影响不显著（P >0.05）， 影响柴胡皂苷转移率的主次因素为B >A>C，与直观分析结果相同。 结合生产成本，确定复方柴胡的最佳提取工艺条件为乙醇浓度80%，回流时间60 min，溶剂倍量15 倍。

表4 正交试验方差分析

2.3.3 提取条件的验证 为验证工艺的准确性和合理性，按上述最优工艺进行提取，平行操作3 份，计算 SSa、SSd 转移率。 结果显示最优工艺下，SSa、SSd 的转移率分别为 68.72%、20.05%，RSD 分别为2.64%、4.08%， 说明该提取工艺稳定、可行。

3 结论

由单因素试验和正交试验结果可知， 各因素中回流时间对柴胡皂苷转移率影响最大， 其次是乙醇浓度。 结合生产成本， 确定复方柴胡饲料添加剂的提取工艺为乙醇浓度80%， 提取时间60 min， 溶剂倍量 15 倍，SSa、SSd 的转移率分别为68.72%、20.05%，RSD 分别为 2.64%、4.08%，表明该提取工艺条件稳定、可行。