基于传统分类与ITS序列分析法对真菌的鉴定研究

朱链 侯怡铃 白鑫 杨彤 陈茜 丁祥*

(1 西华师范大学生命科学学院，四川 南充 637000；2 西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川 南充 637000；3 西华师范大学环境科学与工程学院，四川 南充 637000）

鉴别真菌的传统方法主要为观察真菌的形态和微观特征，辅以生理、生化和营养试验。但是，对于许多大型真菌来说，如果仅从真菌的形态、生理和生化特性来鉴定，不仅要求鉴定者有丰富的真菌鉴定工作经验，同时还要花费大量的时间。尤其对于某些生长条件特殊的、形态相似性高的真菌，如果仅仅通过传统的表型特征来识别，通常会产生假阳性或假阴性结果，较难区分[1]。当今核酸分子生物学技术已应用于各学科。真菌核酸基因组中有4个编码核糖体RNA的基因(rDNA），该序列高度保守，并包含可变区和高变区。编码rRNA的核苷酸序列随时间变化非常缓慢，可用于相对较远生物体的进化比较。因此对rDNA的序列分析可用于鉴定未知分子量或验证表型鉴定结果[2-5]。笔者参照文献从形态特征对来自四川省宜宾市老君山的6株真菌和四川省甘孜藏族自治州雅江县的6株真菌进行初步鉴定，并用rDNA-ITS序列分析法对菌株的宏观鉴定做补充和修正。

1 材料与方法

1.1 真菌样本采集地概况

雅江县位于四川省甘孜藏族自治州，地处青藏高原东缘的高山峡谷与草原的过渡带，地形复杂，形成了独特而神奇的自然景观，且丰厚的土壤也为许多真菌提供了理想的生长环境。真菌样本采集地海拔4 218 m，北纬29°41.902′，东经101°09.4208′。

老君山位于四川省南部，有较原始的森林植被。该地雨量充沛，光照适宜，土壤有机质丰富，适宜真菌生长。真菌采集地海拔1 193 m，北纬27°50′，东经103°36′。

1.2 试验材料

真菌样品于2019年8月采集于四川省宜宾市老君山(标记为13号、14号、15号、19号、20号、24号）和四川省甘孜藏族自治州雅江县(标记为Y30号、Y31号、Y41号、Y46号、Y61号、Y83号）。采集真菌过程中记录其生长环境、生长习性，拍照，然后将其晾干带回西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，储存于-80℃冰箱。

1.3 主要试剂

2×Taq PCR Master Mix(武汉天一辉远生物科技有限公司），DNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒(天根生物科技有限公司），PCR引物(成都生工生物技术有限公司），乙醇等化学试剂(成都金山化学试剂有限公司），ddH2O(实验室自制）。

1.4 主要仪器

台式离心机Mikro 120(北京博瑞祥腾科技有限公司），PCR仪Thermal Cycler 2720(Applied Biosystem美国应用生物系统公司），电泳仪DYY-6 C(北京六一仪器厂），紫外分析仪Gel DocTMXR+(BIORAD伯乐生命医学产品有限公司），ABI 3730 3730 XL(Applied Biosystem美国应用生物系统公司）。

1.5 试验方法

1.5.1 传统分类法鉴定

根据12株真菌菌株形态学特征，参照《中国大型真菌彩色图谱》[6《]中国大型菌物资源图鉴》[7《]中国真菌志》[8]鉴定其种属。

1.5.2 真菌总DNA提取

取10 mg样品菇体，将其剪碎，迅速加入液氮研磨成粉状，之后转移至2 mL离心管，65℃水浴30～40 min，然后加入800 μL体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇溶液，摇匀静置15 min，12 000 g离心10 min。将上清液转移至灭菌离心管中，加入1 mL 95%冰冻乙 醇，用 手 轻 摇2 min，-20℃冷 冻 至 少0.5 h，12 000 g离心10 min，弃上清液，加入1 mL 70%乙醇，静置5 min，12 000 g离心10 min，弃上清液。在洁净工作台中干燥沉淀物，再溶于50 μL TE缓冲液中提取总DNA，并放入-20℃冰箱保存以待扩增。

1.5.3 真菌基因组ITS序列PCR扩增

PCR扩增参考文献[9]。

1.5.4 PCR结果检测

取扩增反应产物7.0 μL并与6×Loading Buffer混匀，在含有10 mg/mL Gold View 3%的琼脂糖凝胶上点样，于1.0×TAE缓冲液(电压为120 V）中电泳。电泳结束后取出凝胶放在凝胶成像系统中，观察并拍照。

1.5.5 ITS片段纯化以及测序

根据PCR电泳的结果，将500～700 bp的目的条带用无菌手术刀切下，并用凝胶回收试剂盒回收纯化，将纯化后的PCR产物送北京奥维森基因科技有限公司进行上下游引物双向测序，得到测序结果。

1.6 进化树的构建

将测序结果利用BankIt工具上传至GeneBank，获得登录号，选择其中最短的扩增序列，以此长度为基本比对长度，在NCBI(National Center for Biotechnology Information）数据库寻找登记序列中含有与12种真菌样品序列相似度高的片段，通过BLAST工具和DNAMAN软件对序列进行分析，截去两侧扩增差异较大的碱基对，使比对的序列大小几乎一致，重新用Clustalx软件进行完全比对，用MEGA7.0软件采用邻位相连法(N-J，neighbor-joining）构建系统进化树[10-12]。

2 结果与分析

2.1 传统分类法的初步鉴定结果

采集的12株真菌菌株形态特征如图1。根据其生境形态特征(菌盖、菌环、菌褶、菌柄等）及文献[6-8]初步鉴定：13号为黏滑菇Hebeloma；14号、15号、19号和20号为粉褶菌Entoloma；24号为球盖菇Hy⁃pholoma；Y30号、Y31号、Y41号、Y46号、Y61号、Y83号均为丝膜菌Cortinarius。

图1 12株真菌生境形态特征

2.2 PCR扩增结果

提取12株真菌菌株总DNA，进行PCR扩增，其rDNA-ITS的PCR扩增产物进行凝胶电泳后均能扩增出目的条带，扩增产物分子量均在500～750 bp(图2）。

图2 12株真菌菌株的rDNA-ITS PCR扩增电泳图

2.3 DNA-ITS序列测序与比对结果

将12种真菌样品的扩增测序结果上传至Gene-Bank，获得其登录号。13号样品登录号为PW911200963，14号样品登录号为PW911130573，15号样品登录号为PW911130578，19号样品登录号为PW911151178，20号 样 品 登 录 号 为PW 911151190，24号样品登录号为PW911200959，Y30号样品登录号为NR131871.1，Y31号样品登录号为NR153055.1，Y41号样品登录号为NR154868.1，Y46号样品登录号为NR153055.1，Y61号样品登录号为NR131871.1，Y83号样品登录号为NR154868.1。将样品序列与从GeneBank获取的相似较高序列经DNA-MAN和Clustalx软件比对分析，并用MEGA7构建N-J系统发育树(图3）。根据系统发育树并结合各比对指标来确定距离与相似性均具有较大鉴定意义的比对序列[13-15]。13号(PW911200963）与Hebeloma limbatum(Bull.）Quél.的相似性达99%；14号(PW911130573）、15号(PW911130578）与奥米粉褶菌Entoloma omienseE.HoraK.相似性达99%；19号(PW911200963）与灰粉褶菌Entoloma ameidesFr.相似性达99%；20号(PW911151178）与白方孢粉褶菌Entoloma murrayialbusLiu相 似 性 达99%；24号(PW911200959）与簇生黄韧伞Hypholoma fascicu⁃lareQuél.相似性达99%；Y30号(NR131871.1）与布里丝膜菌Cortinarius bulliardii相似性达99%；Y31号(NR153055.1）与Cortinarius ferrugineifolius相似性达99%；Y41号(NR154868.1）与Cortinarius decipiens相似性达99%；Y46号(NR153055.1）与Cortinarius hinnuleocervinus有较高的相似性；Y61号(NR131871.1）与布里丝膜菌Cortinarius bulliardii有较高相似性；Y83号(NR154868.1）与Cortinarius de⁃cipiens相似性达99%。

图3 12株真菌菌株的rDNA-ITS序列的N-J系统发育树

3 小结与讨论

采用传统分类与分子生物学相结合的方法鉴定采自四川省宜宾老君山6株真菌菌株，四川省甘孜藏族自治州雅江县6株真菌菌株，结果表明，传统分类法与rDNA-ITS序列分析法鉴定结果一致。

传统分类结合现代分子技术是鉴定真菌种类非常重要的方法。在应用传统分类法鉴定时需要鉴定者准确分析真菌的形态特征并依据真菌鉴定图谱找到可能的真菌种类，因此传统分类法要求鉴定者有丰富经验，鉴定真菌难度较高。分子序列相似性分析比较尽管更有参考作用，但不同物种之间的ITS序列差异越来越小，因此仅依靠分子生物学方法也不能准确鉴定出真菌的种类，所以分子序列分析与传统的分类方法相结合才能更准确鉴定种属，也更客观。