石仙桃总黄酮提取工艺优化及抗氧化活性分析

鞠玉旋，谢倩，陈清西

（福建农林大学园艺学院，福建福州 350002）

石仙桃（Pholidota chinensisL indl），兰科石仙桃属多年生附生草本植物，俗称石上莲、石橄榄、石穿盘等，主要分布于我国云南、广东、广西、福建等省份，常以附生方式生长于海拔100～2700 m的山区林下、树上及岩石缝隙中[1-3]。研究表明，石仙桃主要化学成分为萜类、酚类、黄酮类、多糖、菲类、生物碱等，因其具有养阴润肺、清热解毒、利湿消瘀等功效，常用全草或假鳞茎入药治疗头疼、头晕及咳血等疾病[4-5]。目前对石仙桃的研究主要集中在其化学成分的研究上，包括多糖、菲类、总酚以及总黄酮等的研究，对石仙桃繁殖以及栽培研究较少[6-10]。

石仙桃跟铁皮石斛、金线莲等兰科植物一样含有黄酮类成分，黄酮类成分具有局部麻醉、镇痛、抗氧化、抗惊厥等多种药用疗效，可广泛应用于医疗研究[11-13]。目前总黄酮提取主要有乙醇回流法、热浸提法、超声波提取法、微波提取法等方法[14-16]。该研究以乙醇-水作为提取体系，采用超声辅助法作为石仙桃总黄酮提取方法，并通过响应面法优化石仙桃总黄酮的提取率，为石仙桃总黄酮提取提供优化工艺。通过研究石仙桃总黄酮对DPP H自由基和羟自由基的清除能力，探讨其是否具有体外抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料。石仙桃全草采集于福建省泉州市南安市向阳乡都山农林专业合作社林下中草药种植基地。

1.1.2 主要仪器与试剂。①仪器：LG J-25C型真空冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；AT Y124型电子天平，岛津（中国）有限公司；K Q-300DE数据超声清洗仪，昆山超声仪器有限公司；X M TD-8222恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；S L-250型高速中药多功能粉碎机，浙江松青仪器厂；Tecan Infinite F200/M200型多功能酶标仪，瑞士Tecan集团公司。②试剂：芦丁，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；V C，上海生工工程股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，东京化工株式会社；无水乙醇、水杨酸、A l（NO3）3、N a NO2、N a O H、F eS O4·7H2O、30%H2O2均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 石仙桃样品预处理。挑选从基地采摘的生长较好的石仙桃植株，摘除枯叶及干瘪假鳞茎，挑选成熟饱满的假鳞茎，用清水清洗后，经双蒸水浸泡冲洗后自然晾干，放置-40℃冰箱进行预处理，冷冻后采用真空冷冻干燥机于-40℃，100 pa条件下，冻干至恒重，干燥样品用中药粉碎机磨碎，过60目筛，粉末装入50 mL冻存管放入-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 标准曲线绘制。精确称取芦丁20 mg，溶于80%乙醇，定容至100 mL，配成0.2 mg/mL芦丁标准液，分别取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL至10 mL刻度试管中，补充80%乙醇至5 mL加5%亚硝酸钠0.5 mL，摇匀静置5 min，加10%硝酸铝0.5 mL，摇匀静置5 min，加4%氢氧化钠3.0 mL，加80%乙醇定容至刻度，摇匀静置15 min。依次吸取反应液300μL，使用酶标仪测定波长510 nm处反应液吸光值。以标准品浓度x为横坐标，吸光度y为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.3 石仙桃总黄酮提取。精确称取石仙桃粉末1.000 g，置于100 mL三角瓶内，设定超声温度为60℃，超声时间30 min，在不同的超声辅助提取条件下超声提取，抽滤后多次洗涤合并滤液，定容到100 mL，即得石仙桃总黄酮提取液。

1.3 单因素试验

选择提取次数、乙醇浓度、超声功率和料液比进行单因素试验，考察各因素对石仙桃总黄酮提取率的影响。

1.3.1 提取次数对总黄酮提取率的影响。精确称取石仙桃粉末1.00 g，加入浓度为80%的乙醇溶液，超声功率420 W，料液比1∶40（g/mL），提取温度60℃，提取1～4次分别合并提取液并定浓缩容至100 mL待测。

1.3.2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响。精确称取石仙桃粉末1.00 g，提取3次，超声功率420 W，料液比1∶40（g/mL），提取温度60℃，加入50%～90%浓度乙醇溶液对石仙桃总黄酮进行提取，分别滤过提取液合并浓缩定容到100 mL待测。

1.3.3 超声功率对总黄酮提取率的影响。精确称取石仙桃粉末1.00 g，提取3次，加入浓度为80%的乙醇溶液，料液比1∶40（g/mL），提取温度60℃，设定300～540 W的超声功率对石仙桃总黄酮进行提取，分别合并提取液并浓缩定容到100 mL待测。

1.3.4 料液比对总黄酮提取率的影响。精确称取石仙桃粉末1.00 g，提取3次，加入浓度为80%的乙醇溶液，提取温度60℃，超声功率420 W，料液比1∶30～1∶50（g/mL）对石仙桃总黄酮进行提取，分别合并提取液并浓缩定容到100 mL待测。

1.4 响应面优化试验设计

以单因素试验的结果为基础，选择对石仙桃总黄酮提取影响大的因素为考察条件，设定超声温度为60℃，超声时间为30 min，提取3次，以液料比（A）、超声功率（B）、乙醇浓度（C）为考察因素，以总黄酮提取率为响应值，根据响应面Box-Behnken试验设计原理，进行三因素三水平响应面试验（表1）。

表1 响应面法实验因素水平

1.5 总黄酮提取率测定

精密吸取样品液1 mL至10 mL刻度试管中，加入80%乙醇补充至5 mL，按照标曲测定方法中自“加5%亚硝酸钠0.5 mL”方法开始，每个处理重复3次，在510 nm波长测定吸光度，根据标曲计算总黄酮的质量浓度，代入公式（1）计算总黄酮提取率，公式如下。

式中：C为标曲内计算得总黄酮质量（mg）；VT为提取液体积（mL）；VS为测定液吸取体积（mL）；n为稀释倍数；m为样品质量浓度（g）。

1.6 石仙桃总黄酮体外抗氧化活性测定

1.6.1 对DPP H自由基清除能力测定。参照陈建福、杨美莲等[17-18]的方法并略做修改。取2 mL不同浓度的石仙桃总黄酮提取液于10 mL刻度试管中，加入2 mL 0.2 mmo L/L的DPP H-乙醇溶液，充分混匀，放置阴暗处避光条件下反应30 min，酶标仪波长517 nm处测得吸光度为A1；取同样体积95%乙醇代替DPP H-乙醇溶液与石仙桃总黄酮提取液反应，混匀后阴暗处避光处理30 min，在波长517 nm处测得吸光度为A2；以95%乙醇代替总黄酮提取液与DPP H-乙醇溶液充分混匀作为空白对照组，避光条件下反应30 min，在波长517 nm处测得吸光度为A0。以相同体积分数VC作为阳性对照，按照公式（2）计算总黄酮对DPP H自由基的清除率。

式中：A1测定组吸光度；A2对照组吸光度；A0空白组吸光度。

1.6.2 对羟自由基清除能力测定。参照唐静月等[19]的方法并略作修改。取1 mL不同浓度的石仙桃总黄酮提取液于10 mL刻度试管中，依次加入9 mmoL/L的水杨酸-乙醇溶液和9 mmo L/L的F eS O4溶液各1 mL，充分混匀后加入0.01%H2O2溶液1 mL，用95%乙醇定容至刻度，混匀后在37℃恒温水浴锅反应30 min，在波长510 nm处测定吸光度为A1；以单蒸水代替H2O2按照相同处理加入以上试剂在波长510 nm处测得吸光度为A2；以单蒸水代替样品溶液按照相同处理加入以上试剂测定510 nm处吸光度记为A0。以相同体积分数VC作为阳性对照，按照公式（3）计算总黄酮对羟自由基的清除率。

式中：A1测定组吸光度；A2对照组吸光度；A0空白组吸光度。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线绘制

以芦丁作为标准品，在510 nm测定吸光度，吸光度（y）作为纵坐标，质量浓度（x）作为横坐标，绘制标准曲线，计算得线性回归方程：y=0.926x+0.0141，R2=0.9967。

2.2 单因素结果分析

2.2.1 提取次数对总黄酮提取率的影响。从图1可以看出，石仙桃总黄酮提取率受提取次数影响的变化幅度较小，在提取次数增加时总黄酮的提取也会小幅上升，在设置提取次数为4次时，提取次数达3次时，提取率达到最高，超过3次提取率下降，故提取3次为提取总黄酮的最优次数。

图1 提取次数对总黄酮提取的影响

2.2.2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响。从图2可以看出，石仙桃总黄酮提取率随着乙醇浓度的提高呈先增大后减小的趋势，且当加入浓度为70%乙醇溶液时，石仙桃总黄酮提取率达到最高，随后提取率开始下降，故浓度为70%乙醇对总黄酮提取的最佳浓度。

图2 乙醇浓度对总黄酮提取的影响

2.2.3 超声功率对总黄酮提取率的影响。从图3可以看出，石仙桃总黄酮提取率随着超声功率的变大而呈现出先增长后下降的趋势，且超声功率对总黄酮提取影响较大，当功率在420 W时提取率最高，当超声功率大于420 W时总黄酮提取率逐渐下降，提取率下降较小，故420 W是对石仙桃总黄酮提取的最佳功率。

图3 超声功率对总黄酮提取的影响

2.2.4 料液比对总黄酮提取率的影响。从图4可以看出，石仙桃总黄酮提取率随着料液比的变大而呈现先增长后下降趋势，当料液比在1∶40（g/mL）时，总黄酮提取率达到最高，后呈现下降趋势，故以1∶40（g/mL）对石仙桃总黄酮进行提取。

图4 料液比对总黄酮提取的影响

2.3 响应面优化确定石仙桃总黄酮的提取工艺

2.3.1 模型的建立及显著性分析。以单因素试验的结果为优化基础，采用Design Expert 11软件，以石仙桃总黄酮提取率为响应值，根据Box-Benhnken试验设计原理，对试验数据进行多元回归拟合，分析各因素对总黄酮提取率的影响（表2）。

从表2可以看出，用Design Expert 11对试验数据进行分析，得到石仙桃总黄酮提取率预测值（Y）与液料比（mL/g）、超声功率（W）、乙醇浓度（%）的多元回归模型：Y=1.31+0.013 8A+0.020 0B+0.001 3C-0.007 5A B+0.0100A C+0.0075B C-0.0315A2-0.0240B2-0.0215C2。从表3可以看出，该回归模型P值为0.0008，P＜0.01，表明该二次方程回归模型拟合极显著，且失拟项P为0.9264，其值＞0.05，表明试验结果与拟合值差距不显著，可用于总黄酮提取的模型分析。由表内F值及P值可知各因素的影响效应为：提取功率＞液料比＞乙醇浓度。回归方程一次项C不显著（P＞0.05），A、B项极显著（P＜0.01），二次项A2、B2、C2极显著（P＜0.01），交互项表现均不显著（P＞0.05），说明各试验因素与石仙桃总黄酮提取率之间不是简单的线性关系，该模型与试验的拟合度好，可以对石仙桃总黄酮的提取率进行预测与分析。

表2 响应面设计方案与结果

表3 回归方程方差分析

2.3.2 模型验证及工艺确定。通过Desig n Expert 11软件绘制3个因素之间交互作用对石仙桃总黄酮提取率的影响的曲面图和等高线分析，从图5可以看出，3个因素交互作用的响应面图相对较为陡峭且具有一个相交最高点，等高线图均呈椭圆状，交互作用对石仙桃总黄酮的提取都具有明显的影响，会随着因素条件的优化而增加，说明通过调节超声功率、料液比和乙醇浓度3个因素可以提高石仙桃总黄酮的提取率。

图5 各工艺条件交互作用对总黄酮提取的影响

利用响应面模型和试验数据得到石仙桃总黄酮提取最佳优化方案为液料比38.60∶1（mL/g），超声功率418.224 W，乙醇浓度76.525%，在此条件下得到总黄酮提取率为1.291%，为了在实际试验中更好地操作，将各提取条件修正为液料比40∶1（mL/g），超声功率420 W，乙醇浓度75%，并将此方案进行验证性试验，重复3次，获得试验平均值为1.30%，与预估值仅差0.69%，与预估值差距不显著，证明此方案可用于石仙桃总黄酮的提取。

2.4 石仙桃总黄酮体外抗氧化活性分析

2.4.1 DPP H自由基清除能力测定结果。从图6可以看出，在不同提取液浓度下，石仙桃总黄酮与对照品VC对DPP H自由基清除率随着浓度的增大而逐渐提高，石仙桃总黄酮的清除率低于V c对照品清除率，清除能力最高可达88.35%，其与V c对照品相差10.25%，在对DPP H自由基的清除上具有差距，但同时说明石仙桃总黄酮对DPP H自由基具有较好的清除能力。

图6 DPPH自由基清除能力测定结果

2.4.2 羟自由基清除能力测定结果。从图7可以看出，石仙桃总黄酮对羟自由基的清除率与对照品V c的清除率呈正相关，石仙桃总黄酮的清除率低于V c对羟自由基的清除率，其清除率可达93.04%，与V c对照品相差6.24%，其在对羟自由基的清除上具有差距，说明石仙桃总黄酮对羟自由基也具有较高的清除能力。

图7 羟自由基清除能力测定

3 结论与讨论

石仙桃具有治疗头疼、眩晕、恶心、痢疾等疾病的功效[20]，同时也具有较好的观赏价值，其主要化学成分为多糖、黄酮类、多酚类、脂肪类、萜类、菲类等[6，21-24]。该研究以石仙桃总黄酮提取工艺优化为研究方向，目前总黄酮的提取方式主要有乙醇回流法、热浸提法、超声波提取法、微波提取法等[6，21-24]。刘建新[27]采用乙醇-回流法以正交试验得到最佳提取条件为提取温度60℃，料液比1∶50（g/mL），提取时间50 min，石仙桃总黄酮提取达22.03 mg/g；陈文娟[27]以热浸提法获得石仙桃总黄酮最佳工艺参数为提取温度66℃，乙醇浓度65%，料液比30 mL/g，提取时间151 min，石橄榄总黄酮提取率达1.23%；刘建新[29]采用微波辅助提取法获得石仙桃总黄酮提取工艺为微波功率300 W，提取时间30 min，提取温度60℃，料液比1∶20（g/mL），石仙桃总黄酮提取达31.41 mg/g。由此看来，不同提取工艺对石仙桃提取率的影响较大，这可能是因为不同的提取工艺对石仙桃总黄酮的溶出影响较大，在提取过程中不同的黄酮类物质溶出的提取条件不同，导致部分黄酮类成分无法溶出或分解失效，因此各提取工艺的提取率不同，若要获得最佳提取率必须选择相应的提取条件才能够达到最佳的提取效果[14，16，30]。

总黄酮具有较好的体外抗氧化活性[15]。唐静月[19]等研究铁皮石斛花总黄酮对DPP H自由基、羟自由基和A B T S自由基的清除能力发现，总黄酮含量与抗氧化活性具有相关性；李亚军[31]等研究发现黑老虎总黄酮具有较好的抗氧化活性，其与VC对照品相比较对自由基的清除率略低；吴岩斌[32]提取金线莲总黄酮进行抗氧化试验，结果表明总黄酮的清除能力随着浓度的升高而增强，且有一个最高点，并且不同时期和不同栽培模式对其影响也不同。通过参考他人的结果显示，多种中草药都具有抗氧化活性，该试验在参照陈建福与唐静月的试验方法的基础上，考察石仙桃总黄酮的抗氧化活性，以VC为阳性对照，结果表明石仙桃总黄酮对DPP H自由基和羟自由基的清除能力低于VC对照品，但也具有较好的抗氧化活性。

该研究采用超声辅助方法，以单因素试验结果选择影响因素进行响应面优化试验，得到最佳工艺条件为料液比1∶40（g/mL），乙醇浓度75%，超声功率420 W，在此条件下，得到石仙桃总黄酮最大提取率为1.30%。超声辅助提取法与其他提取方法相比操作简单，且提取率较高，并且能够节省时间，成本较低。同时考察石仙桃总黄酮的抗氧化活性，以VC为阳性对照，结果表明石仙桃总黄酮对DPP H自由基和羟自由基均具有较好的清除能力，其清除能力低于VC对照，石仙桃总黄酮具有较好的体外抗氧化活性。此研究以超声辅助法为提取方法，优化了石仙桃总黄酮的提取方法，同时考察了其抗氧化活性，可以为石仙桃化学成分和抗氧化活性以及药用价值的研究提供指导。