番茄灰叶斑病人工接种技术研究及抗病种质资源筛选

张子君，孙亚男，王涛，张逸鸣，邹庆道

（辽宁省农业科学院蔬菜研究所，辽宁沈阳 110161）

番茄灰叶斑病在传统番茄生产上并不是主要病害，但近20年来由于国外品种的引进推广，番茄灰叶斑病逐渐从次要病害上升为主要病害，并呈现出暴发流行的趋势。辽宁省番茄保护地栽培面积大，栽培环境长年温暖潮湿，很适合番茄灰叶斑病发生。近年来，该病在辽宁地区发病日趋严重，对该病的研究也越来越受到科研人员的关注与重视。选育抗病品种是最经济有效的防病措施，研究、选择适宜的抗病性鉴定方法，从而真实地反映材料抗性水平，是抗性资源筛选及抗病品种选育的关键和基础。该研究对番茄灰叶斑病抗性鉴定方法进行了研究，并对抗病资源进行了筛选，以期为抗病育种工作的深入开展提供一定指导依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试番茄材料：LN89、LN163、金棚一号、L-402、多丽、金冠五号、金冠九号、粉太郎5号、佳宝十八、金圆宝抗T y新组合29、金圆宝抗T y新组合35、荷兰金粉番茄抗T y、倍盈、凯美瑞、瑞菲、齐达利、粉娘、园艺红玛瑙。L N89是由品种桃太郎8号经7代自交分离筛选出的稳定自交系，LN163是由品种欧贝经7代自交分离筛选出的稳定自交系，经田间观察和预备试验筛选，LN89对番茄灰叶斑病抗性良好，L N163易感番茄灰叶斑病；供试病原菌匍柄霉属茄匍柄霉（Stemphylium solani Weber）在PDA培养基上扩繁，20℃培养10 d；供试番茄和番茄灰叶斑病病原菌材料均由辽宁省农业科学院蔬菜研究所番茄课题组提供。

1.2 方法

1.2.1 番茄灰叶斑病人工接种。以抗病材料L N89和感病材料L N163为试材，选取6～7片真叶的番茄幼苗，分别采用喷雾法、涂抹法和菌片贴接法3种方法接种，考察不同接种方法的发病情况。其中喷雾法和涂抹法病原菌孢子浓度为7×104个/mL，喷雾法用喷壶将孢子悬浮液均匀喷雾于叶片至有水滴滴落，涂抹法用胶头滴管吸取孢子悬液2 mL均匀涂抹在番茄植株叶片上；菌片贴接法从菌落边缘打取直径0.4 cm的菌片，将带有PDA培养基的菌片粘贴在番茄植株叶片上，每个羽状叶接1个菌片。接种前1 d营养钵中浇足水，接种后24 h之内保持相对湿度100%，24 h后湿度降至60%～80%，温度控制在（23±2）℃，每天光照12 h。

采用4叶期、6叶期、8叶期的番茄幼苗，喷雾法接种，病原菌孢子浓度为7×104个/mL，考察不同苗龄接种后的发病情况。接种后保湿时间、温度、光照条件同前。

选取6～7片真叶的番茄幼苗采用喷雾法接种，研究病原菌孢子浓度和保湿时间与发病的关系，设5×104个/mL、7×104个/mL、10×104个/mL共3个孢子浓度梯度，接种后保持相对湿度100%，设24 h、48 h、72 h、96 h共4个保湿时间梯度，接种后温度、光照条件同前。以上每个处理接种10株，3次重复，随机排列。

1.2.2 番茄种质资源的抗病性鉴定。采用苗期喷雾法进行抗病性鉴定，采用6～7叶期的番茄幼苗，病原菌孢子浓度为7×104个/mL，接种后保湿24 h。接种后温度、光照条件同前，每个处理接种10株，3次重复，随机排列。

1.3 测定方法

接种7 d后调查番茄植株发病情况，病害调查标准参照Cho等致病力分级方法进行分级调查。番茄灰叶斑病病情分为5级：1级，叶片上无症状；2级，有黑色枯死点，占叶面积10%以下；3级，病斑面积占叶片面积的11%～20%；4级，病斑占叶面积21%～50%；5级，病斑占叶面积50%以上。根据单株病害等级计算病情指数，再根据病情指数划分为不同抗感类型：0≤病情指数≤15为高抗（HR）；15＜病情指数≤30为抗病（R）；30＜病情指数≤50为中抗（M R）；50＜病情指数≤70为感病（S）；70＜病情指数≤100为高感（HS）。

2 结果与分析

2.1 番茄灰叶斑病人工接种技术研究

2.1.1 不同接种方法的致病效果。不同接种方法下，抗病材料L N89病情级数都是0级，没有发病，植株正常生长。感病材料L N163的发病情况以喷雾法发病最重，全株萎蔫干枯，植株基本停止生长；涂抹法发病也较重，下部叶片基本已枯萎，上部叶片有大量病斑；菌片贴接法发病最轻，病斑基本未扩展。由表1可知，喷雾法和涂抹法都能有效区分出抗感材料，抗病材料L N89表现为抗病，感病材料L N163表现为感病，真实地反映出材料的抗性水平；由于菌片贴接法发病最轻，感病材料L N163叶片只有少量病斑，表现为抗病，没有真实反映出该材料的感病程度，可见菌片贴接法不是适宜的接种鉴定方法。喷雾法和涂抹法均是适宜番茄灰叶斑病人工接种的方法，但苗期大规模接种，以喷雾法更为简便适用。

表1 不同接种方法番茄幼苗的病情指数

2.1.2 不同苗龄番茄幼苗接种的致病效果。从表2可以看出，不同苗龄番茄幼苗接种后发病差异显著。4叶期时感病材料L N163发病较轻，表现为抗病，不能真实反映出材料的抗性水平，不是适宜的接种苗龄。而6叶期和8叶期的番茄幼苗接种后均能有效地区分出抗感材料，因此，6叶期和8叶期是适宜的番茄幼苗接种苗龄。

表2 不同苗龄番茄幼苗接种番茄灰叶斑病的病情指数

2.1.3 不同接种浓度和保湿时间的致病效果。在相同的保湿时间条件下（表3），孢子浓度越大，感病材料发病越严重。在相同的孢子浓度下，保湿72 h和保湿96 h，植株叶片脱落严重，影响调查结果和后续植株定植。接种孢子浓度为5×104个/mL，保湿48 h和接种孢子浓度为7×104个/mL，保湿24 h这2个处理都能使植株充分发病。因此，6～7叶期苗龄的番茄材料适宜接种的孢子浓度和保湿时间是5×104个/mL，48 h或7×104个/mL，24 h。

表3 不同孢子浓度和保湿时间处理的番茄幼苗的病情指数

2.2 番茄主栽品种的抗病性鉴定

从表4可以看出，多丽、金冠五号和粉太郎5号表现为抗病；金冠九号、佳宝十八、金圆宝抗T y新组合35、荷兰金粉番茄抗T y和倍盈表现为中抗；金棚一号、L-402、凯美瑞、瑞菲、粉娘和园艺红玛瑙表现为感病；金圆宝抗T y新组合29和齐达利表现为高感。这一结果与生产实践中的观察基本吻合，品质粉果番茄对灰叶斑病往往有一定的抗性。

表4 不同番茄主栽品种的病情指数

3 结论与讨论

喷雾接种法是番茄灰叶斑病人工接种最适宜的方法，6～8叶期为植株的适宜接种时期，适宜接种的孢子浓度和保湿时间分别为5×104个/mL，48 h或7×104个/mL，24 h。对主栽品种采用喷雾接种法进行抗病性鉴定，筛选出3个抗病品种多丽、金冠五号和粉太郎5号，5个中抗品种金冠九号、佳宝十八、金圆宝抗T y新组合35、荷兰金粉番茄抗T y和倍盈，其余主栽品种全部感病。

当前生产上番茄灰叶斑病日趋严重，抗病育种工作势在必行，而抗病资源的筛选是选育抗病品种的基础和前提，建立适宜的人工接种技术体系，真实地反映资源材料的抗性水平，才能够有效地进行抗病资源的筛选。该试验结果表明，喷雾法和涂抹法是适宜的灰叶斑病接种方法，两种方法各有优点，喷雾法效率高，可以用于大量材料的接种鉴定；涂抹法效率相对较低，但可以定量接种，从而更精准地反映材料的抗性水平。关于接种时期，该试验结果认为6～8叶期苗龄较为适宜，但考虑到后续定植，建议选用6叶期番茄幼苗更为适宜。植物的阶段抗病性较为复杂，若成株期与苗期抗性差异较大，建议结合成株期鉴定，以使结果更加可靠。接种浓度和保湿时间也是影响接种鉴定结果的重要因素，该试验建议适宜的接种浓度和保湿时间是5×104个/mL，48 h或7×104个/mL，24 h。该试验中主栽品种的抗病性鉴定中，筛选出3份抗病品种、5份中抗品种，这与生产实践中的观察结果基本一致。了解主栽品种对主要病害的抗性水平，选择适宜当地种植的番茄品种，可有效降低番茄生产中品种选择的盲目性，为农民增产增收提供保障。