蝗虫取食对毛花雀稗防御酶活性的影响

何 应，马向丽，任 健，代微然，毛如志

（1. 云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 650201；2. 云南农业大学科学技术处，云南 昆明 650201；3. 云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201）

植物在生长发育过程中会受到各种胁迫因子的影响，通常分为生物和非生物胁迫因子，其中生物胁迫因子主要包括昆虫、微生物(细菌、真菌、病毒)和线虫等[1-2]。在这些生物胁迫中，昆虫胁迫对植物的影响较大。为抵御害虫，植物在长期进化过程中形成了一系列完整有效的防御策略[3]，特别是组成型抗性和诱导型抗性是植物防御害虫的两种重要机制[4-5]。诱导型抗性是指植物在遭受害虫胁迫时一些防御酶基因被诱导表达，从而激活防御酶活性，并生成一些防御物质的过程[6]。该过程通过改变植物自身代谢方式以抑制或减少害虫的危害，通常会使植物产生一些驱避害虫的气味或者改变挥发性次生化合物的组成和比例，以引诱害虫的天敌捕食或寄生，该过程会使植物的某些防御酶系及其活性发生改变[7]。近年来，国内外学者已对多种植物防御酶应对害虫胁迫的调控机制进行了一定的研究[8]。防御酶主要有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)、 脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)以及过氧化物酶(peroxidase, POD)等。植物防御酶活性会受害虫胁迫的影响而发生改变，并调控相关防御物质的合成[3,9]。岳文波等[10]研究发现，斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、二斑叶螨(Tetranychus urticae)和西花蓟马 (Frankliniella occidentalis)取食菜豆(Phaseolus vulgaris)后，植物体内POD、CAT 和SOD 活性显著升高；西花蓟马取食植物后，可诱导植物防御酶CAT、POD、PPO、LOX 和PAL 活性升高[11-13]；棉铃虫(Helicoverpa armigera)、斜纹夜蛾和叶蝉(Empoasca kerri)取食花生(Arachis hypogaea)后，植物体内防御酶POD、PPO、LOX、PAL、SOD 和CAT 活性均升高，以应对昆虫取食胁迫[14]。

毛花雀稗(Paspalum dilatatum)属于多年生暖季型牧草，原产于南美洲，在我国亚热带地区分布较广，具有产草量较高、适口性好、营养较为丰富且多年刈割不退化等特点，是建植栽培草地的优良牧草[15-16]。毛花雀稗在种植过程中会遭受多种昆虫取食危害，蝗虫(Oxya chinensis)是最常见的一种，其取食是否会引起毛花雀稗植株系统防御尚不清楚。为此，本研究以总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)、8 种防御酶[POD、LOX、CAT、PPO、酪氨酸解氨酶(tyrosine ammonia- lyase, TAL)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)、PAL 和SOD]活性和植物总酚(total phenols, TP)含量为指标，研究蝗虫取食毛花雀稗植株后不同时间内植物体内防御酶活性、总抗氧化能力和TP 含量的动态变化，探讨昆虫诱导植物防御反应的时间效应，旨在进一步揭示牧草应对昆虫取食胁迫的防御机理，为害虫防治提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

毛花雀稗种子采自贵阳市花溪区，在室内人工气候箱内进行盆栽种植[(25 ± 1) ℃、相对湿度70% ±5%、光周期14 h/10 h (黑夜/白天)]，待植株长出8～10 片叶时开始处理。本试验所用蝗虫为中华稻蝗(Oxya chinensis)，虫源采集于贵阳市花溪区野生草坪，在人工气候箱内用人工种植的毛花雀稗饲养，取3 日龄成虫作为供试虫源。

1.2 试验设计

选取健康、长势一致的毛花雀稗植株作为试验材料，将6 盆植株置于方形纱网笼(1.2 m × 1.2 m ×1.0 m)中，取大小一致的3 日龄蝗虫雌成虫15 头饥饿24 h 后，放入笼中进行取食。对照组(CK)不放入蝗虫。分别在蝗虫取食24、48、72 和96 h 后，对被取食过的毛花雀稗植株叶片进行取样。每个处理重复3 次。所有样品用液氮速冻后置于−80 ℃冰箱中保存备用。

1.3 测定指标及方法

测定指标包括总抗氧化能力(T-AOC)、抗氧化酶(POD、CAT、SOD)、酚类相关酶(TAL、PPO)、其他防御酶(LOX、PAL、GST)活性和植物总酚(TP)含量。其中，总抗氧化能力、SOD、PAL、TAL、GST 活性及植物总酚(TP)含量采用苏州科铭生物技术有限公司生产的试剂盒测定，测定方法参照说明书。POD、CAT、PPO 和LOX 活性测定方法参考陈奕磊等[17]。

1.4 数据分析

利用Excel 2016 作图；用SPSS 19.0 软件采用Duncan 新复极差检验法分析各处理间的差异显著性(P< 0.05)。

2 结果与分析

2.1 总抗氧化能力(T-AOC)变化

蝗虫取食胁迫毛花雀稗植株不同时间后植物体T-AOC 有所不同。随着取食时间的延长， T-AOC 总体上表现出先上升后降低的趋势。与CK 相比，在24 h 时 T-AOC 显著升高(P< 0.05)，在48、72 和96 h时 T-AOC 均显著低于CK 组(P< 0.05)，但三者之间无显著差异(P> 0.05) (图1)。

图1 蝗虫取食不同时间后毛花雀稗的总抗氧化能力Figure 1 Total antioxidant capacity (T-AOC) of dallisgrass at different times after grasshoppers feeding

2.2 抗氧化酶POD、CAT 和SOD 活性变化

蝗虫取食胁迫下，毛花雀稗植株中POD 活性在48、72 和96 h 时较CK 均显著升高(P< 0.05)，分别为CK 的1.63、1.65 和1.53 倍，而取食24 h 后POD 活性变化不显著(P> 0.05)；CAT 活性在各时段较CK 均有所升高，其中在24 和96 h 时显著高于CK (P<0.05)，分别为CK 的1.80 和1.36 倍；SOD 活性在24 h时与CK 相比有所升高，但差异不显著(P> 0.05)，在48、72 和96 h 时均显著降低(P< 0.05) (图2)。

图2 蝗虫取食不同时间后毛花雀稗POD、CAT 和SOD 活性Figure 2 POD, CAT and SOD activity of dallisgrass at different times after grasshoppers feeding

2.3 酚类代谢关键酶TAL、PPO 活性及总酚(TP)含量变化

毛花雀稗植株中TAL 活性随蝗虫取食胁迫时间的增加呈先升高后降低的变化趋势，在24、48、72 和96 h 时TAL 活性均显著高于CK (P< 0.05)。其中，在48 h 时TAL 活性达到最高，为CK 的3.71 倍；在24 h 时次之，为CK 的3.07 倍；在72 和96 h 时分别为CK 的2.14 和1.57 倍。而PPO 活性随取食时间的延长也呈先升高后降低的趋势，且在24、48、72 和96 h 时PPO 活性均显著高于CK (P<0.05)，其中在72 h 时达到最高，为CK 的2.10 倍；在48 h 时次之，为CK 的1.80 倍。此外，蝗虫取食24、48、72 和96 h 后， 毛花雀稗植株中TP 含量与CK 相比均显著升高(P< 0.05)，且随着取食时间的延长呈先升高后降低的趋势。其中，在24 h 时TP 含量达到最高，为CK 的1.85 倍；在48、72 和96 h 时，分别为CK 的1.26、1.21 和1.38倍(图3)。

图3 蝗虫取食不同时间后毛花雀稗TAL 和PPO 活性及TP 含量Figure 3 TAL, PPO activity and TP content of dallisgrass at different times after grasshoppers feeding

2.4 其他防御酶LOX、GST 和PAL 活性变化

蝗虫取食胁迫24、48、72、96 h 后，毛花雀稗植株中LOX 活性随取食时间的延长呈先升高后降低再升高的变化趋势，除72 h 外，LOX 活性在24、48 和96 h 时均显著高于CK (P< 0.05)，尤其是取食48 h 后LOX 活性达到最高，为CK 的1.50 倍。毛花雀稗植株中GST 活性变化更为明显，且随蝗虫取食胁迫时间的延长呈先升高后降低的趋势，与CK 相比，在取食24、48、72 和96 h 后GST 活性均显著升高(P< 0.05)。其中，在24 h 时GST 活性达到最高，为CK 的21.25 倍；取食48 h 时GST 活性次之，为CK 的13.75 倍。相反，PAL 活性随取食时间的推移呈先降低后升高趋势，与CK 相比，取食24、48、72 和96 h 后PAL 活性均显著降低(P< 0.05) (图4)。

图4 蝗虫取食不同时间后毛花雀稗LOX、GST 和PAL 活性Figure 4 LOX, GST and PAL activity of dallisgrass at different times after grasshoppers feeding

3 讨论

害虫作为植物生长发育过程中的一种重要胁迫因子，能够诱导植物体内产生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)毒害物质[18-19]。而总抗氧化能力是评价生物体内氧化还原状况的有效指标，能够反映生物体系中氧化剂与抗氧化剂之间的动态平衡关系[20]。本研究中，蝗虫取食胁迫24 h 时，毛花雀稗植株中总抗氧化能力显著高于对照组，说明蝗虫取食促进了毛花雀稗植株中ROS 累积，植株体内活性氧清除系统的清除能力加强，以便清除多余的自由基。随着蝗虫取食时间的延长，总抗氧化能力呈先升高后降低再升高的趋势，在一定程度上反映出长时间的取食胁迫使毛花雀稗植株不能有效地清除多余的自由基，从而无法抵御自由基造成的损伤[21]。

POD、CAT 和SOD 作为植物防御系统中主要的抗氧化酶，在清除植物体内多余氧化自由基、维持体内活性氧的平衡中起到重要作用[22-23]。例如，端大蓟马(Megalurothrips distalis)成虫和若虫取食胁迫菜豆 (Phaseolus vulgaris)、豇豆(Vigna unguiculata)和蚕豆(Vicia faba)后，叶片中抗氧化酶活性随着取食时间的延长而升高[24]。在害虫胁迫下，抗氧化酶活性的变化与植株部位、酶的种类有关。例如，绿盲蝽(Apolygus lucorum)取食胁迫冬枣(Ziziphus jujuba)后，嫩叶中SOD、CAT、POD 活性显著升高，枣蕾中SOD 活性无明显变化，而POD、CAT 活性显著升高，花朵与幼果中SOD、POD 活性无显著变化，而CAT 活性显著升高[25]；斜纹夜蛾、二斑叶螨和西花蓟马取食胁迫菜豆植株后，植物体内抗氧化酶活性显著升高[10]。在本研究中也发现，蝗虫取食胁迫后，毛花雀稗植株中POD 和CAT 活性在某些取食时间下出现显著增强，而SOD 活性在大取食时段下出现显著降低，表明蝗虫取食胁迫下能激发POD 和CAT 积极参与植物防御反应，以维持正常代谢。

酚类物质是植物体内代表性的防御物质，一些研究者认为植物体内酚类物质的变化与阻止害虫取食的防御作用密切相关[26-28]。本研究中发现蝗虫取食胁迫不同时间后毛花雀稗植株中TAL 活性和TP 含量均显著升高，这与胡杨(Populus euphratica)、印加树(Inga vera)幼苗植株遭害虫胁迫后叶片中总酚的变化规律相一致[29-30]。据张绍升等[31]报道，TAL是酚类物质合成过程中的关键酶，其活性的升高有利于酚类物质的形成。此外，有研究表明植物遭受害虫胁迫时，组织的腔室结构释放出PPO，而PPO是酚类代谢系统中的关键酶，酚类物质经PPO 催化后生成木质素及醌类化合物，构成保护性屏蔽阻碍昆虫取食，醌类物质有一定毒性，能够对害虫形成有力的防御作用[32-33]。在本研究中，蝗虫取食胁迫不同时间后毛花雀稗植株中PPO 活性均显著升高。这些结果表明毛花雀稗受到蝗虫取食胁迫后，能通过诱导防御酶TAL 催化合成更多的酚类物质，并进一步通过提高PPO 活性以催化酚类物质生成木质素及醌类化合物来抵御蝗虫取食为害。

植物GST 是一种普遍存在的参与多种细胞功能的蛋白酶，参与初生代谢、次生代谢，能减少除草剂毒害、使植物免受氧化损伤及隔离异源物质等[34]。本研究发现，蝗虫取食胁迫不同时间后毛花雀稗植株中GSTs 活性均显著升高，这利于保护植物免受氧化损伤；同时，蝗虫在取食过程中难免会将一些唾液分泌到植株及伤口处，GST 作为异源物质的隔离保护酶能够发挥重要作用。另外，本研究还发现蝗虫取食后，植株中LOX 活性显著升高(72 h 除外)，LOX 作为一种广泛存在于植物体内的双加氧酶，能够催化植物体内多种多元不饱和酸发生一系列氧化反应最终生成茉莉酸(jasmonic acid)，而该途径中生成的一系列环状或脂肪族化合物在植物应对害虫胁迫过程中发挥重要作用。因此，LOX 是毛花雀稗应对害虫胁迫调控的关键酶之一[35-36]。此外，PAL 作为莽草酸代谢途径中的一个限速酶，能够催化L-苯丙氨酸脱氨基转化为反式肉桂酸[37-38]。有研究发现害虫胁迫能诱导PAL 活性上升[39]，而本研究中发现PAL 活性在蝗虫取食胁迫不同时间后均显著降低，其原因有待进一步探究。

4 结论

蝗虫取食胁迫后，毛花雀稗体内POD、LOX、CAT、PPO、TAL、GST 活性以及TP 含量均出现在部分取食时间或所有取食时间下显著升高。其中PPO、TAL 和GST 活性均随取食时间的延长呈先升高后降低的变化趋势，分别在72、48 和24 h 时达到最高，且显著高于对照。相反，PAL 和SOD (24 h 除外)活性在蝗虫取食胁迫下均显著降低。总之，POD、CAT、PPO、TAL、GST 和LOX 等防御酶在毛花雀稗防御害虫胁迫中发挥了非常重要的保护作用。