hTERT 基因多态性与结肠癌遗传易感性研究

袁志丽，徐保华，杜文贞，杨楠，张晓，司君圣

（山东省烟台市开发区业达医院 消化内科，山东 烟台 264000）

0 引言

人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因定位于5p15.33，为单拷贝基因，全长约41Kb，hTERT 是端粒酶中起催化作用的亚单位，通常被作为调控端粒酶活性的限速步骤而参与肿瘤的发生发展[1]。多项研究证实，hTERT 基因的多个SNP 位点与多种肿瘤发生有关，如神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、食管癌等[2-9]。目前有关hTERT 单核苷酸多态性在结肠癌发病过程中的作用尚鲜有相关报道。本研究拟采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析方法对结肠癌、结肠腺瘤、健康体检者hTERT 基因rs2853676 和rs2853677 位点单核苷酸多态性的分布进行调查，结合分析其与结肠癌临床病理参数关系，探索与结肠癌易感性关系及增值侵袭发病过程中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年1月-2018年12月在烟台业达医院内镜活检或术后组织病理确诊为结肠癌186例、结肠腺瘤194例为病例组，以烟台地区无肿瘤病史、健康体检行结肠镜检查未见明显异常健康者406例为对照组，按性别和年龄（±5 岁）与病例组匹配。收集研究对象外周血标本2mL，并进行面访调查，包括详细的人口学资料、吸烟、饮酒及肿瘤病史等内容。

纳入标准：所有患者均知情且同意；所有研究对象均为汉族。病例组排除合并其他系统或器官恶性肿瘤者，综合结肠癌患者组织病理、腹部CT 或磁共振结果进行临床分期，结肠腺瘤组排除增生性、炎性及错构瘤性息肉者。该研究获得烟台业达医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 DNA 提取

选用广东东胜生物科技有限公司提供的外周血DNA 提取试剂盒提取白细胞DNA，紫外分光光度计检测DNA 含量及质量，OD260/OD280 均位于1.6～1.8，含量80～120ng/μL 视为合格，-20℃冰箱保存备用。

1.3 基因型分析

采用PCR-RFLP 进行基因多态性检测。

使用primer premier 5.0 引物设计软件，按照引物设计基本原则设计各位点引物，并于基因全序列内核对，避开变异位点，提高扩增片段特异性，引物由上海生工生物有限公司合成。PCR 反应体系均采用15μL 反应体系，反应条件为94℃预变性5min，然后进行35 个循环：94℃变性30s，分别以59.5℃、64.0℃退火30s，72℃延伸45s，终末以72℃延伸10min，扩增的DNA 片段长度分别为501bp、404bp，凝胶电泳及随机抽取部分扩增产物基因测序对PCR 扩增产物鉴定质控。对rs2853676、rs2853677 位点PCR 扩增产物分别采用限制性内切酶NaeI、FauI 进行酶切，凝胶电泳观察DNA 条带分析基因型。随机抽取10%样本双向测序验证，测序结果与酶切结果均一致。

1.4 观察指标

病例组和对照组一般信息比较。hTERT 基因SNP 位点基因型分布及其与结肠癌易感性关系。rs2853677 位点基因多态性与结肠癌临床病理参数的关系。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计学软件，采用χ2检验进行Hardy-Weinberg 平衡检验。以t检验和χ2检验比较人口学特征和位点基因型在病例组与对照组之间频率分布差异，以OR（odds radio）值及95%置信区间（CI）表示相对危险度，以P＜0.05（双侧）为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

病例组和对照组的年龄和性别构成差异无统计学意义，说明病例对照匹配合适，吸烟及饮酒无明显统计学差异。

表1 病例组与对照组一般情况

2.2 遗传平衡检验

经χ2检验，所选各组样本均符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群代表性。

2.3 hTERT 各SNP 位点基因型分布

（1）rs2853676 位点各基因型在对照组、结肠腺瘤组及结肠癌组中分布差异无统计学意义（P＞0.05）。rs2853677 位点结肠癌组CC 基因型分布频率（17.74%）明显高于对照组（8.62%），差异具有统计学意义（P＜0.05）,较结肠腺瘤组（10.30%）差异无统计学意义（P＞0.05）。携带CC 基因型者罹患结肠癌风险增加2.193倍（95%CI：1.287-3.373），（如表2 所示）。各位点PCR-RFLP 酶切电泳图如图1、图2 所示。rs2853677 位点结肠腺瘤组+结肠癌组TT、TC、CC 基因型分布频率分别为52.37%、33.68%、13.95%，与对照组相比CC 基因型分布差异具有统计学意义（P=0.028），OR=1.682（95%CI：1.053-2.685）。

图1 hTERT rs2853676 位点PCR-RFLP 酶切电泳图

图2 hTERT rs2853677 位点PCR-RFLP 酶切电泳图

表2 hTERT 基因SNP 位点基因型分布及其与结肠癌易感性关系

（2）rs2853677 位点基因多态性与结肠癌临床病理参数的关系。rs2853677 位点CC 基因型可显著增加结肠癌患病风险，我们进一步对该位点基因多态性与结肠癌临床病理参数进行分析，结果显示该位点各基因型分布频率与结肠癌患者的性别、年龄、肿瘤分化程度差异无统计学意义（均P＞0.05），见表3。

表3 rs2853677 位点基因多态性与结肠癌临床病理参数的关系

3 讨论

结肠癌的病因尚未完全清楚，目前认为主要是环境与遗传因素综合作用的结果。近年研究发现hTERT在正常细胞中不表达，而在包括结直肠癌在内的约90%的肿瘤细胞中表达水平明显增高[10]，亓玉琴等[11]研究发现结直肠癌组织及外周血hTERT mRNA 表达明显升高，并与结直肠癌的转移有关。多项全基因组关联研究（GWAS）表明，hTERT 有多个单核苷酸多态性位点与多种肿瘤易感性有关，包括神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、食管癌等多种恶性肿瘤，与结直肠癌遗传易感性尚鲜有报道。

rs2853676位点定位于hTERT 第2内含子，Shete 等[12]进行的GWAS 表明，该位点与胶质瘤风险有关。2016年，He 等[2]对西安地区胶质瘤患者研究发现“A/G”基因型降低了进展生存率，与基因型G/G 相比，“A/A+A/G”降低了复发率，表明该位点多态性与中国人群中胶质瘤的生存和复发率相关，提示其可能作为胶质瘤患者的预后标志物。与肺癌易感性关系研究中，该位点表现出组织学异质性，与肺腺癌显著相关，而与鳞状细胞癌和小细胞癌均无相关性[13]。然而，rs2853676 多态性与癌症之间的确切功能机制仍不清楚，研究表明端粒长度会改变癌症风险，可能还存在该位点与附近其他生物潜在功能多态性或致病突变的高连锁不平衡，此外还可能受环境风险因素或遗传背景影响[14]，有待进一步研究。

rs2853677 位于hTERT 基因转录起始位点的第2 个内含子+7969 碱基对上。rs2853677 T 等位基因在不同的癌症类型间表现出多效性。GWAS已确定rs2853677 为日本和非洲裔美国人肺癌易感位点[15-16]。同一等位基因与睾丸生殖细胞肿瘤和胰腺癌呈正相关，与胶质瘤和肺癌呈负相关[17]。Daniele 等[18]研究发现T 等位基因可导致端粒变长增加胰腺癌患病风险。Li 等[5]研究表明rs2853677的T 等位基因是中国汉族人群对NSCLC 易感性的保护因子。此外，在另一项研究中该位点被确定与骨髓增生性肿瘤有关[19]。2016年一项对肺腺癌的体外功能研究发现，rs2853677 位于hTERT 的增强子功能区域，发现Snail1 可与增强子结合并重组hTERT 基因内的染色质结构从而抑制hTERT 转录，rs2853677 高危型C 等位基因破坏了Snail1 的结合位点，从而消除了Snail1 对hTERT 转录的抑制作用，表明rs2853677 通过改变转录因子的结合亲和力影响hTERT 的转录[3,20]。本研究发现，结肠癌组CC 基因型分布频率较对照组明显升高，差异有统计学意义，结肠癌患病风险增加2.193 倍；结肠腺瘤被看作是结肠癌的癌前病变，与结肠腺瘤组相比CC基因型分布频率差异无统计学意义，我们将二组合并后与对照组相比，发现TC 基因型分布频率差异无统计学意义，CC 基因型分布频率差异仍有统计学意义（P=0.028），风险增加1.68倍（95%：1.053-2.685），我们推测CC 基因型结肠腺瘤患者更易进展为结肠癌，这需要进一步的前瞻性研究证实。另外，值得注意的是2017年Li 等[21]对中国西北地区结直肠癌患者研究发现rs2853676、rs2853677 与结直肠癌易感性无关，rs2853677 位点结果与本研究不一致，这种差异可能受研究人群不同、遗传背景差异或样本量不足有关等因素影响，将来需要进一步研究明确。

综上所述，hTERT 基因rs2853676 位点单核苷酸多态性未明显增加结肠癌患病风险，rs2853677 位点CC 基因型个体罹患结肠癌的风险性增高，该位点的CC 基因型可能与结肠癌遗传易感性有关。CC 基因型结肠腺瘤患者是否更易进展为结肠癌有待进一步前瞻性研究证实。