基于高通量测序技术筛选低温秸秆降解菌群的研究

何志刚，刘慧屿，刘艳，隽英华，王秀娟，董环，韩瑛祚

（辽宁省农业科学院植物营养与环境资源研究所，辽宁 沈阳 110161）

玉米秸秆是极为丰富且能直接利用的可再生有机资源。作物秸秆的循环利用是农业有机生产中最经济的，对保持和提高土壤肥力以及农业的可持续发展均有重要作用［1，2］。秸秆含有丰富的有机碳和大量的氮、磷、钾、硅等矿质营养元素［3］，将其还田能够改善土壤结构［4］，提高土壤养分含量，维持作物稳产、高产［5］，优化农田生态环境，是一种促进土壤有机质积累［6，7］、调节土壤温度和水分［8］的农艺措施。辽宁省是我国北方重要粮食主产区，大量玉米秸秆无处安放，如何将秸秆高效、无害化归还到农田土壤中，是现代农业急需解决的问题。秸秆进入农业循环生产，不仅可以达到充分利用其中养分资源的目的，还可以增加土壤碳库储量，减少二氧化碳排放。随着农业机械化发展，辽宁地区玉米秸秆还田规模越来越大，但由于秋冬季节温度过低，秸秆进入土壤后不易腐解，影响翌年作物播种和生长，已成为制约辽宁省玉米可持续发展的关键瓶颈问题。

有学者认为在满足温度条件下，秸秆还田可以明显增加土壤微生物群落的多样性，微生物群落多样性影响秸秆在土壤中的分解速度［9~12］，在通常情况下，秸秆给土壤微生物繁殖提供养分，促进微生物的生长，并提高土壤中微生物的活性［13］。作物秸秆中的纤维素、木质素和半纤维素、蛋白质等物质在土壤中腐解和发酵后转化成土壤有机质［14］，能减缓土壤有机质的下降。为了解决东北地区秸秆不易腐解的问题，有研究者采用秸秆还田时加入腐熟剂，加快秸秆降解和养分释放，缓解秸秆未腐解的负面影响［15，16］，但由于菌种对生存环境要求高，导致稳定性不高、定殖存活效率低以及与土著微生物群落竞争生态位等问题［17，18］，限制了推广应用。有学者研究表明，受大田环境因素与所产纤维素酶的影响，单一微生物菌株很难高效降解秸秆类物质，利用微生物间的协同共生作用将多种纤维素降解菌混合培养，其产酶具有多样性，且有利于提高秸秆类物质的转化率［19］。近年来，刘心吾等［20］报道通过筛选耐高温木质纤维素降解菌株达到降解秸秆的效果；李雯等［21］研究了不同纤维素降解菌对玉米秸秆的降解效果。目前，对于纤维素降解菌的研究主要集中在中高温菌株及常温菌株，对低温降解细菌菌群的研究较少，但低温条件进行富集筛选具有高效、成本低等优点［22，23］。直接筛选组合驯化获得的复合菌系群落结构容易受环境条件影响［24］，且缺少对获得的复合菌系在玉米秸秆降解过程中协同降解的微生物群落变化研究。因此，针对北方寒凉地区玉米秸秆还田关键瓶颈问题，为获得低温高效降解玉米秸秆的复合菌群，本试验进行了玉米秸秆低温降解菌群的富集培养、纤维素酶测定、秸秆失重试验及其微生物群落多样性分析，以期为秸秆综合利用提供试验理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

于辽宁省冬季广泛采集低温环境下菌源样品，如玉米田耕层冻土、林下土等，采集后−20 ℃冰箱保存。

表1 菌源样品来源Table 1 Source of samples

1.2 方法

1.2.1 菌群的筛选

（1） 富集培养基

每一代富集培养均采用赫奇逊富集培养基：KH2PO41.0g，NaCl 0.1g，FeCl·36H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，CaCl2·6H2O 0.1 g，蒸馏水1 000 mL，玉米秸秆1.0 g。秸秆预处理：蒸馏水浸泡过夜，去除可溶性糖，冲洗数次，50~60 ℃烘干备用。

（2） 传代培养

取样品5 g 加入装有50 mL 无菌水的150 mL三角瓶中，120 r·min-1震荡 30 min，吸取悬浊液 1 mL 于盛有富集培养基的三角瓶中，以15 d 为周期（10 ℃）培养箱中震荡 120 r·min-1培养，每 15 d 按5%（V/V）接种量接种到新的富集培养基中，连续传代10 次。

（3） 玉米秸秆失重率的测定

发酵前称量添加干玉米秸秆的质量，发酵结束后，发酵剩余物 8 000 r·min-1离心 10 min，弃去上清液，然后用去离子水洗2 次，收集沉淀物于105 ℃烘干至恒重，测定玉米秸秆失重计算秸秆降解率，以不接菌处理作为对照，设置3 个重复［25］。

（4） 纤维素酶活性的测定

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采用DNS 法见［25］测定传代最后一代培养液的不同纤维素酶活性［以纤维素类物质（滤纸、羧甲基纤维素、脱脂棉、水杨苷）为底物测定降解能力，其中以滤纸为底物的滤纸酶活性（FPA）、羧甲基纤维素为底物的内切-1，4-β-葡聚糖酶活性（CMCase）、脱脂棉为底物的外切-1，4-β-葡聚糖酶酶活性（C1）、水杨苷为底物的β-葡萄糖苷酶活性（BG）］。

1.3 微生物菌群测定

微生物总DNA 的提取采用DNA 提取试剂盒（Power Soil® DNA Isolation Kit），提取微生物总DNA。所提取的总DNA 纯度和浓度用核酸定量仪（Nano Drop ND-1000）检测。各样品纯化后DNA 送至北京百迈客公司应用Illumina 平台的HiSeq 进行测序，分别测定细菌群落。方法见参考文献［26~28］。

1.4 固体发酵培养正交实验

为确定SLX 菌系固体培养基的最佳配方，将麦麸：秸秆粉、水料比、接种量作为三因素三水平正交表设计试验，试验设计方案见表2。

表2 固体培养正交试验设计Table 2 The design of soil orthogonal experiment

1.5 数据分析

根据微生物种群测序结果的Barcode序列和PCR 扩增引物序列，从下机数据中拆分出各样品数据，使用Flash 软件对每个样品的数据进行拼接，得到高通量测序原始数据。进一步去除嵌合体、两端引物以及非靶区域序列后得到有效数据，明确 OTU（Operational Taxonomic Units）为研究中的最小分类单元；然后用综合考虑物种多样性及丰度的weighted unifrac 法进行UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic means）聚类分析；使用 UniFrac 软件中 jackknifed算法进行样本之间的距离计算，将细菌高通量测序得出的细菌丰度指数、多样性指数作细菌矩阵。分析结果使用Canoco5.0 软件制图，其余常规数据采用Excel 进行整理分析作图，采用SPSS 19.6 软件进行相关分析，采用Duncan 法，显著水平0.05。

2 结果与分析

2.1 富集菌群的分解玉米秸秆效果

4 个处理进行富集培养传代10 次后，均由培养开始的淡黄色转为培养结束时的棕褐色；絮状物析出明显（图1），呈现为随着世代的延长，秸秆降解率增长的现象。在最后一个传代周期内，如表3所示，不同处理SLA、SLW、SLX、SLZ 的秸秆失重率分别达到38.00%、41.33%、58.97%、50.10%，分别比2 代培养提高了30%、31.33%、40.97%、30.77%。如表4 所示，不同处理纤维素酶活性表现结果：FPA 酶：SLX＞SLZ＞SLW＞SLA，其中SLX 处理比与 SLA、SLW 提高了 6.97、5.06 U·mL-1，差异显著（P＜0.05）；CMC 酶：SLZ＞SLX＞SLW＞SLA，SLZ 处理比与 SLA、SLW 提高了7.49、6.02 U·mL-1，差异显著（P＜0.05）；C1 酶：SL X＞SLZ＞SLW＞SLA 其中SLX 处理比与SLA、SLW 提高了 4.82、4.64 U·mL-1，差异显著（P＜0.05）；BG 酶：SLZ＞SLW＞SLX＞SLA，处理间差异不显著。分析其中原因：由于富集培养会使某些特定的微生物菌株大量累积，4 个处理的菌源来源不同，导致富集后存在的菌种也存在差异，从不同酶活性变现差异可以看到，SLX 和SLZ 处理的酶活性均高于另外2 个样品，说明这2 个样品中存在的微生物群落更加容易降解玉米秸秆，SLA是采集玉米耕层冻土，从表3 中观察也具有一定玉米秸秆分解能力，但是由于土壤中的菌群降解能力有限，在所有处理中效果最差，也从另一个角度说明北方地区玉米秸秆还田，存在很大难度。通过观察低温继代培养过程中的变化，4 个菌系均具有良好的玉米秸秆降解和纤维素酶活性，具有稳定的分解功能。其中筛选的复合菌群SLX 的玉米秸秆降解率显著高于其他复合菌群，说明复合菌群SLX 具有更高的秸秆降解活性及低温优越性。

图1 不同处理富集传代培养结果Fig.1 Enrichment subculture in different treatments

表3 不同处理分解玉米秸秆降解率Table 3 Degradation rate（DR）of corn stalk decomposed by different treatment 单位：%

表4 不同处理纤维素酶活性变化Table 4 Changes in cellulase activity in different treatments 单位：U·mL−1

2.2 微生物群落多样性指数分析

2.2.1 细菌多样性指数分析

在微生物生态学研究中，OTU（operational taxonomic units）是将基因序列相似性接近97%的定义为一个OTU；Effective Tags 为原始序列过滤后得到的优化序列数再过滤嵌合体后的有效序列数；本研究对不同处理细菌16S rRNA 基因序列进行了高通量测序，删除掉低质量序列后，共得到有效序列量318 356 条，测序平均获得62 348.5 有效片段，被聚类为1 094.9 个OTU，平均长度414 75 bp。微生物群落的均匀度指数（Ace）和多样性指数（Shannon）表 5 中 可 见 ，处 理 SLX 和 SLZ 的OTU 数量达到 1 140.3 和 1 144.7，均高于 SLW 和SLA，差异达到显著水平；SLX 和 SLZ 的 Ace 指数达 到 1 164.1 和 1 169.9，均 高 于 SLW 和 SLA；SLX 和 SLZ 的 Shannon 指数达到 8.33 和 8.2，均高于SLW 和SLA，差异达到显著水平，处理SLX 和SLZ 细菌群落多样性指数和均匀度指数均很高，说明这两个处理的菌群丰富度较高；处理SLX 和SLZ；SLW 和 SLA 分别两样本的 Shannon 指数接近，表示二者之间菌群落结构类似，进一步对比分析。

表5 细菌群落多样性指数分析Table 5 Analysis of Bacterial Community Diversity Index

通过Venn 图（图2）分析了4 个处理细菌共有的优势属（相对丰度＞1%）的数量及特有的优势属，4 个处理优势属共有4 378 个，整体的优势菌属排序：SLX＞SLZ＞SLW＞SLA，3 个处理中均有分布的优势种属有1 138 个；SLX 处理中优势属的种类最多，为1 210 个；SLA 处理中优势属的种类最少，为 1 171 个。从表 5 和图 2 中可见，SLX 处理中富集了更多的参与秸秆降解的微生物，菌种组成多样性较高，菌群结构更加丰富。

图2 细菌群落维恩图Fig.2 Venn diagram of bacterial community

2.2.2 细菌群落组成分析

从图3 中可以观察到，4 个处理中丰度较高的主要类群有：变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、糖化菌门（Saccharibacteria）等。其中SLA 和SLW 中的细菌类型，主要包括变形菌门（Proteobacteria）、装甲菌门（Armatimonadetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、硝化螺菌门（Nitrospirae）；SLX 和 SLZ 主要包括酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Verrucomicrobia）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）等菌群。

图3 不同处理细菌群落热图Fig.3 Bacterial community heat map of different treatments

与 SLA 相比，SLX 和 SLZ 处理均显著增加的门为拟杆菌门（Bacteroidetes）分别增加了18.18%和44.69%；浮霉菌门（Planctomycetes）分别增加了 53.74% 和 60.50%；绿弯菌门（Chloroflexi）分别增加了4.79%和12.35%；变形菌门（Proteobacteria）分别增加了 2.51% 和 3.57%。与 SLA 相比，SLX 和SLZ 处理均显著降低的门糖化菌门（Saccharibacteria）分别降低 27.23% 和 33.98%；放 线 菌 门（Actinobacteria）分 别 降 低 0.58% 和12.34%。与 SLA 相比，酸杆菌门（Acidobacteria）变化幅度较小，SLX 处理增加了3.18%和SLZ 处理降低了1.09%；芽单胞菌门（Gemmatimonadetes），SLX 处 理 降 低 3.18% 和 SLZ 处 理 增 加1.09%。

其中SLA 和SLW 变形菌门相对丰度较高，分别达到 21.4、23.2%，在 SLZ 和 SLX 的处理中，酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）分别比（SLA 和SLW）增加7.86%、2.51%和5.55%。说明以这2个处理，经过低温富集培养，主要增加了酸杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门等菌株。

与 SLA 相比，SLX 和 SLZ 处理丰度均显著增加的属有溶杆菌属（Lysobacter）分别增加101.25% 和 168.19%；拟无枝酸菌属（Amycola⁃topsis）分别增加了149.88%和48.25%；独岛菌属（Dokdonella）分别增加了 112.55% 和 69.71%；Gemmatirora分别增加了220.89% 和719.08%；Haliangium分别增加了135.99%和159.66%；与SLA 相比，降低的属有Rhodoplaner分别降低了54.42% 和 46.48%；Reyranella分 别 降 低 了3.29%和28.07%。其他未分类属种处理间变化差异亦很显著，进一步从SLX 发现，uncultured Acidobacteriaceae，uncultured Sphingomonas 等一些未被鉴定的菌株，分别占细菌总量的3.7%~8.3%。分析可能是一些现阶段未被发现的产纤维素酶的新菌株。

从热图和基于Beta 多样性分析，得到的不同处理UPG-MA 聚类结果见图4。样品越靠近，代表样品物种组成越相似。第一、二主成分轴对细菌群落结构变异解释量分别为32.42% 和22.77%。SLX 和 SLZ 分布在 PC1 轴正向，SLA和 SLW 分布在 PC1 轴反向；SLA 和 SLW 的 微 生物群落聚为一个类群，SLX 和SLZ 微生物群落为一个类群，表明样品来源是影响微生物群落划分的主要因素。

图4 不同处理UPG-MA 聚类图Fig.4 Different processing UPG-MA clustering diagram of different treatments

从图3、图4 可见，不同处理富集了不同菌群，其中 SLX 和 SLZ、SLA 和 SLW 各聚为一个类群，其中SLX 处理是在各处理中是最丰富的细菌类群，菌群相对丰度越高，物种和遗传多样性越丰富，同时也具有广泛的生理代谢功能，其中SLX 主要增加了，酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）是降解木质素的功能群，芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）可能参与木质素和环境污染物的降解，并发现了一些新的菌种。由此可知，SLX 处理中保留了菌源土壤中的功能菌，通过限制性培养使其大量扩繁，大大提高功能菌的丰度，从而促进玉米秸秆的降解。

2.3 细菌群落纲水平与纤维素酶活性响应关系

不同纤维素酶活因子用带有箭头的黑色线段表示，响应变量用带有箭头的蓝色虚线线段表示，其长短代表其在排序空间内的变化量。本研究通过冗余分析探究细菌群落纲水平下4 种不同纤维素酶因子变化趋势。如图5 所示，结果表明不同微生物细菌群落结构对纤维素酶活性对有显著影响，并可以解释微生物群落结构总变异的34.15%。如图 3B 所示 FPA、CMCase、C1 和 BG酶。C1、BG 位于第四象限，C1 与α-变形菌纲（Deltaproteobacteria）、BG 与 β-变形菌纲（Betapro⁃teobacteria）表现正相关；CMCase 和 FPA 位于第二象限，与酸杆菌门（Acidobacteria）表现正相关。

图5 纲水平细菌菌群与不同纤维素酶活冗余分析Fig.5 Redundancy analysis（RDA）of l microbial community structure and different types of cellulase

2.4 固体培养正交实验

通过上述分析，确定以SLX 为下一步试验菌群，通过正交试验明确该菌群的固体培养方案，从表6 和表7 对于FPA 酶酶活各因素按极差大小主次顺序为：C＞B＞A。与FPA 酶活对应的R 值分别为 R1=1.02；R2=1.45；R3=2.37，表明接种量的比例对FPA 酶活的影响最大，FB=28.82＞F0.05=19，Fc=68.89＞F0.05=19，表明 B、C 因素对 FPA酶活影响显著。综合以上分析，得到最佳培养基配方为A1B3C2。

表6 固体发酵正交试验结果Table 6 Results of orthogonal solid fermentation

表7 固体发酵正交试验方差分析结果Table 7 Analysis of variance of the orthogonal experiment of solid fermentation

正交试验结果表明，麦麸∶秸秆粉的比例7∶3时为最佳配比，水料比的最佳比例为1∶1 时，接种量的最佳值为5%。

3 讨论

3.1 不同处理对纤维素酶活性及秸秆降解率的影响

自然界中玉米秸秆的降解是由多种微生物菌株分泌多种木质纤维酶协同完成的［29］。纯培养单一的菌株产生的木质纤维素酶种类较少［30］。现阶段，国内外对人工复配菌群的研究主要集中于1~3 种纯菌混合培养［31］，超过 4 种菌种混合培养的报道很少。同时，约有99%的微生物目前无法培养，所以人工复配的复合菌群并不完全符合自然状态下木质纤维素的分解条件和规律，其降解效率也不高。有一些学者，采集自然界原生态环境样品为接种物，采用限制性富集培养条件，构建了高效降解滤纸、水稻秸秆和纸浆废物等的复合菌群［32~34］。目前对能够高效降解玉米秸秆的低温复合菌群的报道较少。

本试验通过限制性培养条件和连续继代培养，筛选获得了一组高效稳定分解玉米秸秆的复合菌群SLX。与马欣雨等［19］分离筛选到的纤维素分解菌最适生长条件下（温度：30 ℃、pH：7.5），液态发酵培养15 天秸秆降解率达到53.88%。进行比较本实验筛选到复合菌群在温度10 ℃条件下，玉米秸秆的分解率达到58.97%，具有更高的分解效率。SLX 菌群在15 d 内产复合酶系，与陈晶晶［15］分离筛选到高活性纤维素分解菌菌株的CMC 酶活力最高，达25 U·mL-1，比较本试验筛选到复合菌群CMC 酶活力达到10.48 U·mL-1，FPA酶活力达到 9.33 U·mL-1，C1 酶活力达到 5.24 U·mL-1，BG 酶活力达到 1.03 U·mL-1，酶活并不太高，属于中等水平，这可能与培养温度有关，目前对10 ℃低温条件下获得的产高纤维素酶活的菌株的研究报道较少。

发酵条件优化试验常用的设计方法有正交试验设计法、响应面设计法等，一般是由单因素试验确定试验因素与水平，后经多因素设计试验得出多因素试验条件下的最优组合，本实验通过固体正交发酵培养实验结果显示：麦麸∶秸秆比例7∶3时为最佳配比，水料比最佳比例为1∶1，接种量最佳值为5%。本研究为菌系的后续固体发酵试验奠定一了良好的基础。

3.2 不同处理对微生物群落结构的影响

本研究结果表明富集可以增加功能微生物的丰富度和多样性［34~36］，4 个富集菌群丰度较高的主要类群有：变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、疣微菌门（Verruco-microbia）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、糖化菌门（Saccharibacteria）。

4 个 处 理 聚 类 为 2 大 类 ，以 SLA 和 SLW 为 一类，以 SLX 和 SLZ 分为一类，其中 SLX 种群丰富度在不同处理中最高，主要含有酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）拟杆菌门（Verrucomicrobia）的微生物菌株。其中放线菌门（Actinobacteria）的菌株具有优异的纤维素水解能力，厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）是降解木质素的功能群，芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）可能参与木质素和环境污染物的降解，绿弯菌门（Chloroflexi）的菌种相对耐低温，对冬季秸秆的降解具有促进作用。在属分类上uncultured Acidobacteriaceae，uncultured Sphingomonas，为优势菌株。这说明可能存在某些新的菌种。

冗余分析结果表明不同微生物细菌群落结构对纤维素酶活性对有显著影响，并可以解释微生物群落结构总变异的34.15%。C1、BG 位于第四象限，C1 与α-变形菌纲（Deltaproteobacteria）、BG与β-变形菌纲（Betaproteobacteria）表现正相关，其中变形菌纲是土壤细菌中的优势菌种，在森林土壤中是最丰富的细菌类群，相对丰度越高，物种和遗传多样性越丰富，具有广泛的生理代谢功能，在土壤有机物质分解、循环和能量转化中起到了重要作用；CMCase 和FPA 位于第二象限，与酸杆菌门（Acidobacteria）表现正相关，其中酸杆菌门（Acidobacteria）的菌株具有优异的纤维素水解能力，说明上述菌株是产生纤维素酶的主要菌纲。

4 结论

本试验通过对4 组菌源样品的不同纤维素酶活性、秸秆分解效率以及Alpha 多样性、OTU 丰度和差异度、菌群种群结构及含量进行测定，结果表明复合菌群SLX 具有高效稳定分解玉米秸秆的能力。该菌群在15 d 内产生复合纤维素酶系，对玉米秸秆的分解率达到58.97%。在限制性富集继代培养过程中菌种组成多样性较高，菌群结构更加丰富、均匀。菌株主要为酸杆菌门（Acidobacteria）、放 线 菌 门（Actinobacteria）和 芽 单 胞 菌 门（Gemmatimonadetes），在种分类上，uncultured Ac⁃idobacteriaceae，uncultured Sphingomonas等 为 优势菌株。它们均直接或间接参与秸秆降解进程中的酶促反应，外切β-葡聚糖酶（C1）与α-变形菌纲（Deltaproteobacteria）、β-葡萄糖苷酶（BG）与β-变形菌纲（Betaproteobacteria）表现正相关；内切β-葡聚糖酶（CMCase）和滤纸酶（FPA）位于第二象限，与酸杆菌门（Acidobacteria）表现正相关。这可以解释微生物群落结构总变异的34.15%，菌群通过菌种之间的协同作用，共同维持了体系的稳定。固体发酵培养试验结果显示：麦麸、秸秆粉的比例7∶3 时为最佳配比，水料比的最佳比例为 1∶1 时，接种量的最佳值为5%。研究结果为明确低温秸秆降解菌群降解机理和提高纤维素降解效率提供了理论基础。