As 对甜高粱种子萌发及幼苗生理的影响及评价

郝佳丽，白文斌，贾峥嵘，张阳，张建华，曹昌林

（山西农业大学高粱研究所，山西 晋中 030600）

As 是广泛存在于自然界的一种有害类金属元素，是五大剧毒元素之一［1］。我国土壤中As 平均浓度为 11.2 mg·kg-1，约为世界平均值（6 mg·kg-1）的2 倍。土壤As 主要来源于工业生产、农药化肥和集约化养殖等，其进入环境后，能通过生物降解和化学反应转化为迁移能力更强、毒性更大的化合物，造成环境污染。据2019 年全国土壤污染现状调查显示，我国土壤中As 含量点位超标率为2.7%，是仅次于Cd 的第二大污染物。

土壤重金属污染物因其具有隐蔽性、不可逆性和长期性的特点［2］，是影响生态系统安全的一类重要污染物［3，4］。随着化石燃料的日渐短缺和生态环境的持续恶化，当前寻找可再生的清洁能源及治理环境污染已成为人类亟待解决的两大重要问题［5］。植物修复技术已成为当前重金属污染土壤修复的主要途径［6~8］，然而，植物修复技术往往受到复杂的土壤环境和植物自身因素的制约，因超富集植物生物量小、地域性强、难以驯化，使其修复效果降低［9，10］。因此，利用高生物量植物来修复重金属污染土壤已成为植物修复技术中的一种重要途径。

甜高粱作为一种抗逆性较强的高生物量植物［11，12］，既能作为能源植物替代化石燃料减少污染，又能有效吸收土壤中重金属污染物［12，13］。大量研究表明甜高粱较其他作物在吸收重金属方面具有很大的优势。刘晓辉等［14，15］研究不同浓度铝对甜玉米、草高粱和甜高粱的逆境生理的影响，结果表明：甜高粱种子的SOD、POD 活性和MDA、Pro含量都显著高于甜玉米，说明甜高粱种子对铝的抗性高于甜玉米。陈梦妮等［16］研究Pb 胁迫下对甜高粱和玉米苗期的影响，通过分析生理抗性指标，综合评价得出甜高粱的抗逆性显著高于玉米。秦华等［17］研究结果表明在重金属 Pb、Cd 胁迫下，辽甜1 号有较强的吸收转运能力和抗逆性。利用甜高粱修复重金属污染土壤具有广阔的应用前景。

有关重金属砷对不同作物的生长和抗性生理研究报道较少，前人主要研究了不同浓度砷胁迫下作物的生长发育及抗性生理。高雪等［18］研究表明外源砷显著抑制青稞种子的萌发，降低青稞的株高、千粒重和产量。王春梅等［19］研究表明高浓度砷抑制谷子幼苗的生长，降低谷子POD 和CAT活性。Wang 等［20］研究表明砷浓度为 1.0 mg·kg-1胁迫下，凤尾蕨的POD 活性明显降低。然而，不同甜高粱品种在土壤砷胁迫下的响应研究鲜见报道，仅有研究阐述了不同甜高粱品种对砷的吸收转运和积累特性［21］，对甜高粱种子萌发和幼苗生理响应的研究几乎空白。本试验通过室内发芽试验和室外盆栽试验相结合的方法，研究不同浓度重金属As 胁迫下的甜高粱种子萌发和苗期生理特性的影响，旨在探索不同甜高粱种子对重金属As 的反应机制及苗期抗性生理的响应，筛选出抗性能力较强的甜高粱品种，为进一步提高高生物量植物甜高粱对重金属污染土壤的植物修复技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试作物选取5 个抗逆性、抗病性和抗倒伏性较强，且植株高大、生物量高的甜高粱品种，其中2个为分蘖性强、可多次刈割的优质饲用甜高粱：大力士和绿巨人（百绿国际草业有限公司从澳大利亚引进的杂交种）；3 个为含糖量高、生产乙醇的优质能源甜高粱：晋甜杂3 号和晋甜1401（山西农业大学高粱研究所选育），辽甜3 号（辽宁省农业科学院选育）。As 标准贮备液，用 Na3AsO4·10H2O 配制，用去离子水稀释成所需的浓度系列。

1.2 试验设计

1.2.1 不同As 浓度发芽培养试验

试验于2020 年10 月在山西农业大学高粱研究所实验室进行。用去离子水配制5 个不同浓度As 溶液备用，分别为 0、10、20、40、60 mg·kg-1；选取籽粒饱满、整齐一致的种子，用0.1%HgCl2消毒10 min，用去离子水反复冲洗5~6 次，待种子表面水分干燥后，将已消毒的种子整齐排列在直径为12 cm 的培养皿中，每皿 30 粒，重复 3 次，并分别加入10 mL 相应浓度的As 溶液，置于25 ℃恒温培养箱培养。期间每天称重，加各浓度As 溶液至原重。

种子萌发以胚根长度达到种子长度的一半时，开始统计发芽数。培养3 d 后统计发芽势，7 d后随机选取10 粒，测定芽长、根长并统计发芽率，并计算发芽指数、活力指数和根、芽耐性指数。各指标计算公式如下：

发芽指数＝∑（不同时间内的发芽数）/（相应的发芽天数）；

活力指数＝发芽指数×芽长。

耐性指数＝各浓度处理的根（芽）长度/对照组的根（芽）长度×100%。

1.2.2 盆栽试验

本研究采用二因素完全随机区组设计盆栽试验，因素一为甜高粱品种，分别为大力士、绿巨人、晋甜杂3 号、晋甜1401、辽甜3 号；因素二为重金属As 处理，设 0、10、20、40、60 mg·kg-15 个水平，完全组合共25 个处理，3 次重复。

试验在山西农业大学高粱研究所东白基地旱棚中进行。2020 年4 月称取过2 mm 筛的风干土15 kg 装入直径45 cm、内深50 cm 的塑料盆中，按试验设计添加不同浓度的重金属As，混匀，浇水，放置稳定1 周。5 月6 日，选取籽粒饱满的甜高粱种子10 粒播种，每盆留3 株定苗，高粱生长期间适时浇水并及时去除杂草等，于6 月底进行收获。苗期选取长势一致的高粱进行生理指标测定。

1.2.3 测定指标

采用硫代巴比妥酸法测定MDA 含量，采用氮蓝四唑光还原法测定SOD 活性，采用愈创木酚法测定POD 活性，采用茚三酮比色法测定Pro含量［22］。

1.3 数据处理

1.3.1 作图及制表

测定数据采用 Microsoft Excel 2017 和DPS7.05 版软件进行处理和分析，采用Duncan 新复极差法进行多重比较，LDS 法进行差异显著性检验，显著水平为P＜0.05。

1.3.2 统一不同指标的量纲

参考严明建等［23］研究方法，将相应指标的平均值进行标准化转换，求得各测定指标的耐性系数（K）。通过比较K 值大小来消除各项指标的差异。计算公式为：耐性系数（K）=处理测定值/对照测定值×100%

1.3.3 综合评定

逆境下条件种子萌发和幼苗的长势、生理特性均发生相应的变化，单从某一方面分析的抗性较为局限，采用隶属函数法对多项指标进行综合评估能准确、合理的评价植株抗性。本试验采用隶属函数值法［24］，利用模糊数学隶属度公式对各指标耐性系数进行定量转换，分别求出不同甜高粱品种各指标的具体函数值。

种子发芽势、发芽率、根长、芽长、发芽指数、活力指数和幼苗中的POD、SOD 活性和脯氨酸含量的K值越大抗性越强，K值与抗性正相关，采用隶属函数公式：

MDA 含量的K值越大抗性越弱，与抗性呈负相关，用反隶属函数计算其隶属函数值，计算公式：

式中，i 为每个甜高粱品种；R（Xij）为各指标的隶属函数值，R（Xij）［0，1］；Xij为i 个甜高粱品种第j 个指标的K 值；Xjmax和Xjmin分别为不同甜高粱品种第j个指标的K 值的最大值和最小值。

利用模糊学隶属函数值对每种植物的系列发芽指标和抗性生理指标进行计算并求平均值，以评价其重金属抗性顺序。计算公式为：

式中为所有甜高粱品种的第j 项指标的平均值，Vj表示第j 项指标的标准差系数，Wj表示第j 项指标的权重，D 表示不同甜高粱品种的抗性综合评价值，D 值越大，抗性越强。

2 结果与分析

2.1 不同浓度As 胁迫对甜高粱种子萌发的影响

由表1 可见，随着As 浓度的增加，甜高粱种子的根长、芽长、发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数都显著降低，根长较芽长降幅较大，高浓度下根长几乎为0，表明As 对根生长的抑制作用较大。其中晋甜 1401 的根长在 As 浓度≥40 mg·kg-1时，显著高于其它4 个品种，芽长差异不显著；而大力士和绿巨人在高浓度As 胁迫下表现较差，根长为0。晋甜杂3 号的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数高于其它品种，且降幅较小，种子萌发特性较强。辽甜3 号的发芽指数和活力指数随着As 浓度的增加降幅都较小，仅次于晋甜杂3 号。大力士和绿巨人在As 浓度为60 mg·kg-1时发芽势和发芽率显著降低。随着As 浓度的增加绿巨人的活力指数极显著低于CK，表明在高浓度As 胁迫下绿巨人的种子萌发特性较差；大力士和晋甜1401 在高浓度As 胁迫下发芽指数和活力指数表现较差。

表1 不同浓度As 胁迫对甜高粱种子萌发的影响Table 1 Effect of different Asconcentrations on sweet Sorghum germination

2.2 不同浓度As 胁迫对甜高粱种子根、芽耐性指数的影响

由图1 可见，随着As 浓度的增加，5 个甜高粱品种的种子根、芽的耐性指数均明显降低；芽的耐性指数都显著高于根的耐性指数。As 浓度为10 mg·kg-1时，大力士的根芽耐性指数最高，当As 浓度≥40 mg·kg-1时，大力士的根耐性指数为0，极显著低于其它4 个品种。晋甜1401 在As 浓度≥10 mg·kg-1时芽的耐性指数低于大力士，高于其他3个品种；但根的耐性指数在As 浓度为10 mg·kg-1时，仅高于绿巨人，As 浓度≥40 mg·kg-1时，晋甜1401 显著高于其它4 个品种，说明晋甜1401 在高浓度As 胁迫下根芽耐性指数较高。总体评价芽的耐性指数的大小为：晋甜1401＞大力士＞晋甜杂3 号＞辽甜3 号＞绿巨人；根的耐性指数大小为：晋甜1401＞晋甜杂3 号＞辽甜3 号＞绿巨人＞大力士。

图1 不同浓度As 胁迫下甜高粱的根芽耐性指数Fig.1 Effect of different As concentrations on root-shoot tolerance indexes of sweet Sorghum

2.3 不同浓度As 胁迫对甜高粱幼苗POD 和SOD 活性的影响

由图2 可见，不同浓度As 胁迫下，甜高粱幼苗POD、SOD 的活性都显著高于CK，而且随着As 浓度的增加，POD、SOD 的活性都呈先升高后降低的趋势，说明As 浓度增加可诱导甜高粱幼苗体内POD 和SOD 的活性增加，以消除As 的毒害作用，但是超过一定范围，就会抑制其活性。大力士POD 的活性在 As 浓度为 20 mg·kg-1时最高，其他四个品种幼苗的POD 活性在As 浓度为40 mg·kg-1时最高；大力士和绿巨人SOD 的活性在As 浓度为20 mg·kg-1时最高，其他3 个品种幼苗的SOD活性在 As 浓度为40 mg·kg-1时最高；说明大力士和绿巨人幼苗在As 浓度≥40 mg·kg-1时受到As胁迫明显，而晋甜1401、晋甜杂3 号和辽甜3 号在As 浓 度 为 60 mg·kg-1时 才 会 受 到 As 胁 迫 的影响。

图2 不同浓度As 胁迫下甜高粱幼苗中POD 和SOD 的活性Fig.2 Effects of different As concentrations on the activities of POD and SOD of sweet sorghum seedlings

2.4 不同浓度As 胁迫对甜高粱幼苗中MDA 和Pro 含量的影响

由图3 可见，不同浓度As 胁迫下，甜高粱幼苗中MDA 含量呈上升趋势，显著高于和Pro 含量都显著高于CK，而且随着As 浓度的增加，MDA 和Pro 含量都呈升高趋势。MDA 含量增加说明甜高粱幼苗在As 胁迫下都发生了膜脂过氧化作用，随着As 浓度的增加，大力士的MDA 含量增幅最大，其次是绿巨人，而晋甜杂3 号和辽甜3 号的MDA含量增幅较小，根据MDA 含量变化幅度的大小，可以反映出晋甜杂3 号和辽甜3 号遭受膜脂伤害较轻。当 As 浓度为 20 mg·kg-1时，5 种甜高粱幼苗中 Pro 含量显著高于 10 mg·kg-1和 CK，当 As 的浓度≥40 mg·kg-1时 ，Pro 含量极显著高于 20 mg·kg-1，而当 As 浓度为 60 mg·kg-1时，大力士、绿巨人和晋甜 1401 的 Pro 含量与 As 浓度为 40 mg·kg-1时的差异较小，而晋甜杂3 号和辽甜3 号的Pro 含量呈显著性差异。

图3 不同浓度As 胁迫下甜高粱幼苗中MDA 和Pro 的含量Fig.3 Effects of different As concentrations on the MDA and Pro contents of sweet sorghum seedlings

2.5 不同甜高粱品种对土壤As 抗性能力大小综合评价

采用隶属函数法对5 个甜高粱品种的种子萌发期相对发芽势、相对发芽率、相对胚芽长、相对胚根长、相对萌发指数、相对活力指数和幼苗期POD 活性、SOD 活性、MDA 含量、Pro 含量进行了综合评价，得到5 个甜高粱品种的对As 的综合抗性能力D 值（表2）。

表2 甜高粱种子萌发期和幼苗期隶属函数综合评价Table2 The comprehensive evaluation of subordinate function of sweet Sorghum germination stages and seedling

5 个甜高粱品种的综合抗性能力D 值在0.207~0.406 之间，其As 抗性能力大小为晋甜1401＞晋甜杂3 号＞辽甜3 号＞大力士＞绿巨人。

3 讨论

种子萌发是植物生长最敏感、最关键的时期，在外源重金属胁迫条件下，能否正常发芽以及发芽状况都可以反映出该种子抗性能力，通常情况下发芽势、发芽指数和活力指数在一定程度上能反映出种子活力状况。本试验中种子发芽各项指标都随As 浓度的增加显著降低，对根长抑制作用大于芽长。这与陈梦妮等［26］研究发现不同浓度Cr6+对3 种甜高粱种子各项萌发指标均产生不同程度的抑制作用结果相一致。说明重金属As 胁迫下甜高粱种子体内蛋白酶等活性受到抑制，影响了种子内蛋白和淀粉的分解，使种子萌发受到抑制。本研究中As 浓度为0 mg·kg-1时，绿巨人的发芽指标最高，晋甜1401 最低，这可能与不同品种基因型的发芽率有较大关系；当As 浓度≥10 mg·kg-1时，晋甜杂3 号和辽甜3 号的发芽指标相对较高，表明其种子萌发特性较强。高浓度As 胁迫下，芽长差异不显著，根长呈显著差异，晋甜1401的根长最大，大力士和绿巨人根长为0。

随着As 浓度的增加，5 种甜高粱种子根、芽的耐性指数均显著降低；芽的耐性指数都显著高于根的耐性指数，这与胡培全［26］研究3 种牧草种子根、芽的耐性指数均随着Cd 浓度的增加而明显降低，且高浓度Cd 胁迫下芽的耐性指数高于根的耐性指数的结果一致。本试验中晋甜1401 在高浓度As 胁迫下根芽耐性指数显著高于其他四个甜高粱品种；大力士的根芽耐性指数在低浓度时最高，但高浓度As 胁迫下显著降低；绿巨人的根芽的耐性指数都较低。说明低浓度As 会抑制种子萌发能力，但随重金属浓度的升高，超出植物的耐性与抗逆性，会造成植物完全丧失发芽能力［27］。因为过量的重金属胁迫会造成种子内细胞膜脂过氧化，使植物体内产生活性氧自由基，导致抗氧化防御系统之间的失衡，从而影响植物正常萌发［28］。

甜高粱幼苗POD、SOD 的活性都随As 浓度的增加呈先升高后降低的趋势，这与郝正刚［29］研究镉胁迫下甜高粱幼苗SOD、POD 和CAT 活性随镉浓度升高都呈先上升后下降的趋势一致。李建刚等［30］研究甜高粱在低浓度镉胁迫下SOD 和POD 发挥抗氧化功能，其活性增加，而高浓度时其活性显著降低。说明在低浓度As 胁迫下，甜高粱幼苗可通过提高体内POD 和SOD 的活性，来降低As 的毒害作用；但高浓度As 使其产生的活性氧自由基超过了其自净阈值，受到的抑制作用增强。本试验中晋甜1401、晋甜杂3 号和辽甜3 号在As浓度为 60 mg·kg-1时，其幼苗 POD、SOD 的活性受到抑制，而大力士和绿巨人幼苗在As 浓度≤40 mg·kg-1时，其 POD、SOD 的活性就会受到抑制。

植株在逆境条件下，除POD、SOD 活性的变化，MDA 和Pro 含量也常作为判断其抗性的重要生理指标。本试验中甜高粱幼苗中MDA 和Pro 含量都随As 浓度的增加呈升高趋势，且都显著高于CK。MDA 含量增加说明甜高粱幼苗在As 胁迫下都发生了膜脂过氧化作用，也反映出植株体内的自由基增加；而Pro 含量的增多可增强植物体内调节渗透压的能力，从而降低毒害作用。本试验中晋甜杂3 号和辽甜3 号的MDA 含量在高浓度As胁迫下增幅较小，可以反映出晋甜杂3 号和辽甜3号的细胞膜脂过氧化作用相对较弱，受到伤害较轻；而大力士的MDA 含量增幅最大，说明其在高浓度As 胁迫下发生较强的细胞膜脂过氧化作用，导致其体内的自由基含量增加，使MDA 含量增加。当 As 浓度为 60 mg·kg-1时，晋甜杂 3 号和辽甜3 号的Pro 含量较低浓度时呈显著性差异，而大力士、绿巨人和晋甜1401 的Pro 含量差异较小。

不同作物、不同指标在不同重金属浓度胁迫下存在不同差异，单项指标不能准确的评价作物的抗逆性，而将各项指标结合起来进行综合评价更可靠。张美俊等［24］采用隶属函数法计算不同糜子萌发期的综合指标来评价糜子的抗旱性；陈梦妮等［25］采用隶属函数法综合评价了3 种甜高粱种子萌发期耐Cr6+性。本试验研究了5 种甜高粱种子萌发期和苗期抗性生理指标，同样采用了模糊数学隶属函数法，综合评价了不同品种甜高粱在As 胁迫下的抗性能力，结果为晋甜1401 的耐As性能力最强，相比其他品种而言，晋甜1401 的根长、芽长、活力指数和抗性生理指标得出的隶属函数值都高于其他品种，而发芽势和发芽率较低，与品种自身芽率不高有关，与抗性能力强弱关系不大；晋甜杂3 号的耐As 性仅次于晋甜1401，由于晋甜杂3 号在高浓度As 胁迫下，各项发芽指标和幼苗抗性生理指标都相对较高，综合得出抗性能力也较强；而大力士和绿巨人虽然发芽率较高，但在高浓度As 胁迫下，发芽指标显著降低，幼苗POD和SOD 活性也较差，计算得出的综合评价D 值也较低，所以抗性能力也较弱。本试验只是通过种子萌发和幼苗抗性生理综合评价其抗性，但植物的整个生育期生理变化比较复杂，应进一步研究多个生育期及植株吸收富集特性进行分析。

4 结论

不同甜高粱品种种子的根长、芽长、发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数和根芽耐性指数都随着As 浓度的增加显著降低，且对根长的抑制作用大于芽长，芽的耐性指数显著高于根的耐性指数。甜高粱幼苗POD、SOD 的活性先升高后降低，MDA 和Pro 含量呈升高趋势。晋甜1401 的根芽耐性指数最高，种子萌发和幼苗抗性指标较高；晋甜杂3 号和辽甜3 号次之，大力士和绿巨人的发芽指标和根芽耐性指数表现较差，且MDA 含量增幅较大，Pro 含量增幅较小。采用模糊数学隶属函数法综合评价5 种甜高粱耐As 性：晋甜1401＞晋甜杂3 号＞辽甜3 号＞大力士＞绿巨人。