基于密度调节的液液微萃取结合高效液相色谱测定药茶、陈醋、汾酒中的双酚A

荆旭 ，蒋海娟 ，白冰 ，王腾飞 ，武文英

（1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801；2.临汾市公安司法鉴定中心，山西 临汾 041000；3.山西农业大学资源环境学院，山西 太谷 030801）

山西药茶有着悠久历史，是我国传统医药学库中药茶的重要组成部分之一［1］，作为中国茶叶品牌的新成员，推出后便受到极大地关注。山西老陈醋是我四大名醋之首［2］，产销量排名全中国第一，行业产值达30 多亿元。汾酒作为中国“老四大名酒”之一，奠定了中国的白酒产业［3］。近年来汾酒的营收增幅很快，已经引起全行业的广泛关注。

双酚A，由于其耐久性和热稳定性，通常用于制造作食品包装、储存和消费的塑料容器［4］，是世界上使用量最多的工业化合物之一［5］，预期到2022年使用量将达到1 060 万吨［6］。在高温、酸性或碱性条件下，双酚A 可从食品接触材料及制品中浸出迁移进入食品，最终随食品进入人体［7］。双酚A具有难降解性，低剂量效应和较强的亲脂性，易于在生物体内富集［8］。微量乃至痕量的双酚A 能对人类造成长期的甚至多代的危害［9］，双酚A 是一种典型的内分泌干扰物。通常双酚A 含量较低，仪器不易直接检出，对其检出的关键在于样品前处理的效果［10］。

目前，许多新的食品样品前处理技术被开发出来。液液微萃取是一种微型化的萃取技术，其优点有操作速度快、溶剂使用量少、萃取高效等，在样品制备领域得到了越来越多的应用［11］，尤其是对于复杂基质的痕量分析［12］。但是，传统的液液微萃取技术往往使用氯仿、二氯乙烷等有害有机溶剂作为萃取剂，还需要使用超声、涡旋、微波等仪器设备辅助提取，不仅对环境造成污染，危害人类的身体健康，而且具有耗时、步骤繁琐的缺点［13］。因此，建立环境友好、快速高效的液液微萃取技术十分必要。

本文建立了一种环境友好、快速高效的基于密度调节的液液微萃取前处理分析方法。以生物衍生溶剂愈创木酚为环境友好的萃取剂，以盐和水作为密度调节剂，通过调节密度实现萃取剂的“上浮-下沉”，促使萃取剂与样品溶液充分反应，实现快速高效的萃取。萃取完成后，萃取剂位于下层，便于收集，使用高灵敏度的高效液相色谱-荧光检测器测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

安捷伦1260 高效液相色谱仪（配荧光检测器）购买自美国安捷伦科技有限公司；

双酚A（纯度＞99.8%）、愈创木酚、氯化钾、氯化钠、硫酸铵、硝酸钠、色谱纯甲醇、乙腈购买自上海阿拉丁科技公司；

连翘药茶样品经磨碎混匀后，准确称取0.5 g，加水100 mL，在80 ℃振摇恒温水浴锅中浸提45 min，冷却后将浸提液离心、过滤，上清液混匀待用。山西老陈醋和汾酒样品经离心、过滤，上清液混匀待用。

1.2 色谱条件

进样量为20 μL，色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为20 ℃，流动相为乙腈∶水（40∶60 v/v），流速为0.5 mL·min-1，激发（发射）波长 282（313）nm，双酚 A的保留时间为12 min。

1.3 萃取步骤

将150 μL 愈创木酚加入含有5 mL 样品溶液的玻璃离心管中，随后加入1 400 mg 氯化钾，由于样品溶液密度的改变，萃取剂愈创木酚在2 min 内上浮到离心管的上端。随后向溶液中加入4 mL水，萃取剂会在两分钟内下沉到离心管的底部。完成萃取后，收集离心管底部的萃取剂，进高效液相色谱-荧光检测器检测分析（图1）。

图1 基于密度调节的液液微萃取结合高效液相色谱测定双酚A 的流程示意图Fig.1 Schematic representation of the density-adiusted liquid-liquid microextraction combined with HPLC for the determination of bisphenol A

1.4 统计分析

使用 SPSS 软件（IBM SPSS Statistics 25）计算每个实验的平均值和标准差，并在95%置信水平下进行方差分析（ANOVA）。

2 结果与分析

2.1 萃取条件优化

2.1.1 萃取剂体积的影响

萃取剂用量过少，会降低萃取效率；萃取剂用量过多，会降低富集倍数［14］。试验研究了愈创木酚体积分别为 100、150、200、250、300 和 350 μL 时对双酚A 峰面积的影响（图2）。结果表明，随着萃取剂体积的增加，峰面积先增大后减少。当愈创木酚的体积为150 μL 时，峰面积达到最大值。因此，本实验选择150 μL 作为萃取剂的体积。

图2 萃取剂体积对峰面积的影响Fig.2 Effect of the volume of extractant on the peak areas

2.1.2 盐种类的影响

在密度调节过程中，加盐对于萃取剂的“上浮”起着决定性的作用。本实验研究了氯化钾、氯化钠、硫酸铵和硝酸钠对双酚A 峰面积的影响（图3）。结果表明，使用氯化钾时峰面积最大。这可能是由于盐析作用和密度等因素共同影响了目标物的萃取［15］。因此，本实验选择氯化钾作为最佳的密度调节剂。

图3 盐的种类对峰面积的影响Fig.3 Effect of types of salt on the peak areas

2.1.3 加盐用量的影响

在调节密度的过程中，加盐的用量会影响萃取效果。本实验研究了氯化钾用量分别为1 300、1 400、1 500、1 600、1 700 和 1 800 mg 时，加盐用量对双酚A 峰面积的影响（图4）。结果表明，随着氯化钾用量的增加，峰面积先上升后下降，当氯化钾用量为1 400 mg 时，峰面积最大。这可能是由于盐的加入加快了萃取剂上浮的速度，而过多盐的加入增加了溶液的粘度，产生了粘性阻力效应［16］。因此，本实验选择1 400 mg 作为氯化钾的用量。

图4 加盐用量对峰面积的影响Fig.4 Effect of the amount of salt added on the peak areas

2.1.4 加水体积的影响

在调节密度的过程中，加水体积是影响萃取剂“下沉”及分配的重要因素。本实验研究了加水体积分别为 3、4、5、6、7 和 8 mL 时，加水体积对双酚A 峰面积的影响（图5）。结果表明，当加水体积为4 mL 时，峰面积最大。这可能是由于水体积的增大加快了提取剂的下沉的速度。当加水的体积过多时，萃取剂中的目标化合物重新分配进入水中，从而峰面积变小。因此，本实验选择4 mL 作为加水的体积。

图5 加水的体积对峰面积的影响Fig.5 Effect of the volume of water added on the peak areas

2.1.5 pH 的影响

pH 决定目标分析物的电离程度，从而影响分配行为［17］。本试验研究了 pH 分别为 1、3、5、7、9 和11 时，pH 对双酚A 峰面积的影响。结果表明，pH对萃取效果并没有显著的影响，因此样品不需要调节pH。

2.2 方法评价

在最优萃取条件下，对所建立方法的线性、检出限和定量限进行了评估。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到的标准曲线方程为y=60.648x+3.762，决定系数R2为 0.999，双酚 A 在0.04~16 μg·mL-1范围内线性关系良好。按照 3倍和10 倍信噪比分别计算双酚A 的检出限和定量限 ，双 酚 A 在 3 种 基 质 中 的 定 量 限 为 0.04 μg·mL-1，检出限为 0.01 μg·mL-1。

2.3 实际样品分析

应用所建立的方法对药茶、陈醋、汾酒3 种基质中的双酚A 含量进行测定，结果显示双酚A 在空白基质中均未检出。为了考察方法的适用性，设置添加浓度为 0.1 和 10 μg·mL-1对双酚 A 进行测定（n=3）。由表 1 可知，双酚 A 在药茶、陈醋、汾酒3 种基质中的加标回收率为73.0%~87.5%，RSD 均在0.9%~3.5%之间，表明本方法正确度和精密度良好。

表1 样品的回收率和相对标准偏差Table 1 Recovery and relative standard deviation of real samples

3 讨论

民以食为天，随着人们生活水平的提高，食品安全问题受到越来越多的关注［18］。预防并降低食品安全问题的发生有助于保障消费者的身体健康。目前，山西药茶、陈醋、汾酒已经受到国内外商客的广泛青睐，安全性也备受广大消费者关注。双酚A 属于典型的内分泌干扰物［19~21］，在食品包装容器中广泛存在［22］，但双酚A 不易监测，关键步骤在于样品的前处理。因此，开发山西特色食品中双酚A 前处理分析方法具有重要意义，建立环境友好、快速高效的有害物质的前处理分析检测方法十分必要。

本文以山西特色产品为样品基质，利用密度调节实现萃取剂的“上浮-下沉”，检测药茶、陈醋、汾酒样品中双酚A 的含量。采用环境友好的生物衍生溶剂愈创木酚为萃取剂，利用密度调节的方法快速高效地完成萃取，不需要额外的辅助提取设备。所建立的方法是一种适用于食品样品的环境友好、快速高效的前处理方法，为食品中有害物质的前处理技术提供了新思路。

通过优化萃取剂体积、盐种类、加盐用量、加水体积和pH 等影响因素，得到了最佳的萃取条件。双酚 A 在 0.04~16 μg·mL-1范围内线性关系良好，检出限为 0.01 μg·mL-1，回收率为 73.0%~87.5%，RSD 均在0.9%~3.5%之间，证明了本方法正确度和精密度良好，并已成功应用于药茶、陈醋和汾酒样品中双酚A 的测定。

4 结论

本文建立了一种基于密度调节的液液微萃取-高效液相色谱检测双酚A 含量的分析方法，并成功应用于药茶、陈醋和汾酒样品。选取生物衍生溶剂愈创木酚作为环境友好的萃取剂，利用密度调节的方法实现了双酚A 快速高效的提取，该方法具有良好的线性关系、正确度、精密度和实用价值。为食品中双酚A 分析方法的开发提供了依据，为建立食品中有害物质的环境友好、快速高效的前处理方法提供了参考。