轮班护士5-羟色胺转运体及1A受体基因多态性与睡眠障碍的关系

闫盼，王晟东，王姝琪，李静，方悦，宋明芬

流行病学调查[1]显示，近1/3的成年人发生过不同程度的睡眠障碍(SD)；近年来因睡眠问题所带来的医疗费用增加和工作效率下降已成为社会广泛关注的公共卫生问题[2]。轮班护士作为特殊职业的群体，承担着紧张、繁杂、高强度的护理工作，作息无规律，其睡眠情况更是不容忽视[3]。研究[4]表明，5-羟色胺(5-HT)作为脑内一种重要的神经递质，参与睡眠的发生和维持；其功能降低是SD的危险因素。5-HT转运体(5-HTT)和5-HT1A受体(5-HTR1A)两者相互协调共同调控突触间5-HT浓度[5]。有研究[6]提示5-HTT基因多态性可能与SD有关，但结果存在争议。经本院伦理委员会审查通过(2018004-09)，本研究以SD的高发人群轮班护士为对象，探讨5-HTT启动子区(5-HTTLPR)、内含子区(5-HTTVNTR)及5-HTR1A启动子区C-1019G位点基因多态性及其交互作用与轮班护士发生SD的关系。

1 对象和方法

1.1 对象

为2018年10月至2020年10月本院从事轮班制工作>6个月、18～50岁的护士138名，排除合并严重躯体疾病或精神心理疾病、正在服用治疗失眠药物者、妊娠或哺乳期妇女及酒精、药物、浓茶和浓咖啡依赖者；所有入组者对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集 采用自编人口学资料问卷，包括性别、年龄、婚姻状况、职称、轮班年限等。由经培训的心理测量师使用匹兹堡睡眠质量指数量表(PSQI)评定入组者睡眠状况，以PSQI总分≥8分为SD组，<8分为非SD组。

1.2.2 基因多态性检测 抽取入组者静脉血2 ml于乙二胺四乙酸抗凝管中，1周内使用苏州旷远生物分子技术有限公司生产的血液基因组提取试剂盒提取DNA，于-80 ℃保存待用。通过GenBank查找5-HTTLPR、5-HTTVNTR和5-HTR1A C-1019G的引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成。见表1。

表1 引物序列信息

PCR反应体系：dNTP mixture 4 μl，2×GC bufffer I 12.5 μl，上下游引物各1 μl，酶Taq 0.25 μl、模板约50 ng。反应条件：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 1 min，退火54～62℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。5-HTTLPR、5-HTTVNTR的产物经2%琼脂糖凝胶电泳50 min后在分子成像系统中观察结果，5-HTR1A C-1019G产物外送测序。

2 结果

2.1 两组一般资料比较

根据PSQI评分，SD组59例(42.75%)，非SD组79例(57.25%)。两组一般资料比较差异无统计学意义。见表2。

表2 两组一般资料比较

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

5-HTTLPR位点SD组(χ2=0.262，P=0.877)与非SD组(χ2=1.028，P=0.598)、5-HTTVNTR位点SD组(χ2=1.771，P=0.413)与非SD组(χ2=3.370，P=0.185)、5-HTR1A C-1019G位点SD组(χ2=0.391，P=0.822)、非SD组(χ2=3.420，P=0.181)与观察值与期望值吻合度良好，均符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.3 两组基因型及等位基因频率比较

5-HTTLPR:两组基因型和等位基因频率比较差异有统计学意义(χ2=6.366，P=0.041；χ2=7.427，P=0.006)，携带S等位基因者发生SD的危险性较L等位基因者高(OR=1.244，95%CI=1.067～1.451)；5-HTTVNTR：两组基因型和等位基因频率比较差异无统计学意义；5-HTR1A C-1019G：两组基因型及等位基因频率比较差异有统计学意义(χ2=14.991，P=0.001；χ2=19.319；P<0.001)，携带G等位基因者发生SD的危险性较C等位基因者高(OR=1.428，95%CI：1.246～1.764)。见表3。

表3 两组5-HTTLPR、5-HTTVNTR和5-HTR1A C-1019G基因型及等位基因频率比较(例数，%)

2.4 5-HTTLPR、5-HTTVNTR和5-HTR1A C-1019G基因-基因交互作用与SD易感性的相关分析

MDR分析结果显示，5-HTTLPR和5-HTR1A C-1019G两位点模型为最优基因-基因交互作用模型，此模型验证样本准确度(0.6483)及交叉验证一致性(10/10)均最高，经1 000次置换检验，差异有统计学意义(P=0.0107)；表明5-HTTLPR和5-HTR1A C-1019G基因-基因交互作用与轮班护士SD易感性有关，其中携带LS/GG、SS/CG、SS/GG基因型组合者为SD高风险基因型个体。见表4，见图1。Logistic回归分析显示，以LL/CC型为参照，SS/GG基因型轮班护士发生SD危险性明显增加(OR=9.429，95%CI：1.023～86.857，P=0.043)。见表5。

表4 5-HTTLPR、5-HTTVNTR和5-HTR1A C-1019G基因-基因交互作用分析

图1 5-HTTLPR和5-HTR1A C-1019G基因-基因交互作用模式图

表5 发生SD的多因素Logistic回归分析

3 讨论

5-HT是最早被研究的与睡眠有关的神经递质，5-HTT是5-HT活性的重要调节因子，通过5-HTT重摄取作用可在数量和作用时间上对5-HT能神经传递进行精细调控[7]。5-HTT编码基因多态性可影响5-HTT基因转录水平和蛋白表达，进而影响脑组织中的5-HT水平[8]。本研究选择5-HTT基因两个重要的功能性位点5-HTTLPR和5-HTTVNTR，探讨5-HTT基因多态性与轮班护士SD易感性的关系，结果显示，5-HTTLPR位点携带S等位基因者发生SD的危险性较L等位基因者高，但5-HTTVNTR位点各基因型与SD无关联。本研究的发现与既往一些研究相似，如Van Dalfsen等[9]通过开展5-HTTLPR多态性与睡眠模式关系的初步研究后发现，携带S等位基因的学生更易持续处于短暂夜间睡眠模式中。张莉等[10]对5-HTT基因多态性与抑郁症睡眠相关因子进行数量性状分析后观察到，5-HTTLPR多态性与抑郁症患者入睡困难、睡眠不深、早醒及睡眠因子评分密切相关，具有S等位基因和SS基因型的患者更易产生SD。

5-HTR1A基因位于人类染色体5q11.2-13区域，是哺乳类动物脑中表达最多的5-HT受体亚型之一[11]。5-HTR1A作为突触前自主受体和突触后受体同时起作用，突触前膜的自主受体被激活后可减少5-HT能神经元的电活动，同时它还通过自我反馈控制5-HT能神经传导，突触后5-HTR1A的激活将引起细胞膜的超极化，从而降低神经元的兴奋性[12-13]。5-HTR1A基因存在若干突变位点，其中最为关注的位点是启动子区C-1019G，该位点基因多态性已被证实与人类情感障碍的发生有关[14-15]，但至今其与SD易感性的关联尚无报道。本研究发现，5-HTR1A C-1019G位点携带G等位基因者发生SD的危险性较C等位基因者高。从5-HTR1A的作用机制分析，可能由于G等位基因削弱了转录调控因子对基因表达的抑制作用，增加5-HTR1A自身受体的表达，从而减少5-HT传递[16-17]，这可能是其成为易感因素的重要机制之一。

鉴于5-HTT与5-HTR1A均是5-HT系统神经传递的重要调节因素，而单个候选易感基因不足以解释SD的发生机制，多个微效基因的联合作用与SD的关联性研究显得尤为重要。因此，本研究在分别探讨了5-HTT(5-HTTLPR、5-HTTVNTR)和5-HTR1A C-1019G各位点多态性对轮班护士睡眠质量影响的基础上，首次分析基因-基因的交互作用与轮班护士SD易感性的关联，结果显示5-HTTLPR和5-HTR1A C-1019G基因存在明显的交互作用，携带SS/GG基因型的个体SD易感性显著增加。

但本研究的样本量偏少、所检测的位点较少。结论有待扩大样本量、探索新的多态性位点进一步证实。