西维来司他对急性肺损伤小鼠NLRP3炎症小体的作用研究*

韩艳奇，高志丹，陈清杰，黄翠萍

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院糖尿病心脑血管湖北省重点实验室；3.湖北科技学院护理学院)

西维来司他(sivelestat，SV)是一种选择性中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，已被报道对内毒素诱导的仓鼠、豚鼠和绵羊肺损伤有效[3-4]。在日本进行的Ⅲ期和Ⅳ期研究显示[5-6]，SV能缩短患者机械通气时间和重症监护病房的停留时间，延长急性肺损伤患者的生存期。但SV与NLRP3炎症小体的关系研究甚少，本研究通过脂多糖LPS复制急性肺损伤小鼠模型，检测肺组织NLRP3炎症小体及其相关信号分子的表达变化，探讨SV对急性肺损伤小鼠肺组织的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要试剂与动物

32只7周龄雄性C57BL/6小鼠，体质量为22～26g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司。LPS购自北京索莱宝科技有限公司(L8880-10mg)；OLT 1177购自上海易汇科技有限公司(HY-W011082)；SV购自上海易汇科技有限公司(HY-17443)；ELISA试剂盒购自武汉赫尔生物科技有限公司(SU-BN20174)；NLRP3抗体购自CST(15101S)；CASPASE-1购自ABclonal(A0964)；p-NF-κB抗体购自ABclonal(AP0123)；NE(ELANE)购自ABclonal(A13015)；IL-18购自Immunoway(YN1926)；IL-1β购自Immunoway(YT2322)；β-actin抗体购自ABclonal(AC026)；BCA蛋白定量试剂盒，购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.1.2 仪器

水平摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；电泳槽、电转膜仪(Bio-Rad公司)；多功能酶标仪(美国Bio-Tek 公司)；化学发光凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；研磨仪(武汉塞维尔生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型与实验分组

将32只C57BL/6小鼠在标准动物饲养间内，给予无菌水和食物饲养一周，随机分为4组(每组8只)：正常对照组(CON)、模型组(LPS)、模型+SV组(LPS+SV)、模型+NLRP3抑制剂组(LPS+OLT)。正常对照组腹腔注射生理盐水(20mg/kg)；模型组腹腔注射LPS (20mg/kg)，制备急性肺损伤(ALI)模型；SV治疗组在造模前5d每天腹腔注射SV(100mg/kg)；NLRP3抑制剂组在造模前12h内腹腔注射OLT 1177(200mg/kg)，分5次给药，最后一次腹腔注射OLT 1177(40mg/kg)1h后，腹腔注射LPS(20mg/kg)。4组小鼠均12h后处死，留取标本，进行下一步实验。

2.1 开发主体环保意识薄弱 旅游资源作为一种资源，不论是可再生还是不可再生，在其使用过程中不可避免会受到破坏，绝大多数生态旅游资源都具有破坏容易恢复难的特性。随着景区知名度的提升，加上游客日益多样化的需求，旅游目的地不得不想办法对资源进行深度的挖掘和再次开发。受经济利益的驱使，常常使得旅游开发具有盲目性，可能会使得资源过度开发而超过自身恢复限度。张家界国家森林公园，由于对修建性建设项目控制不够，造成水质污染，曾被联合国教科文组织亮出黄牌警告，当地政府为了恢复景区原貌，花费了上亿元人民币。

1.2.2 肺含水量测定

取右肺上叶，吸水纸吸干表面水分及血液，称重。置于80℃烘箱72h后称量肺干重，计算湿干重之比(W/D)。

1.2.3 小鼠肺组织中IL-1β表达水平

小鼠颈椎脱臼处死，取右肺下叶部分组织，称重，加入PBS缓冲液(组织∶PBS=1∶9)，冰上剪碎组织，采用研磨仪充分匀浆，收集上清。通过酶联免疫法检测肺组织中IL-1β的表达水平，操作均按ELISA试剂盒说明书进行。

1.2.4 小鼠肺组织中NLRP3炎症小体相关蛋白以及中性粒细胞弹性蛋白酶表达水平

取适量肺组织，称重，加入一定体积比例(组织∶RIPA=1∶30)的RIPA裂解液、PMSF、磷酸酶抑制剂A液、磷酸酶抑制剂B液混合液(RIPA∶PMSF∶PA∶PB=100∶1∶1∶1)，在碎冰上剪碎组织，冰上静置20min，裂解小鼠肺组织，利用研磨仪匀浆，离心，取上清，酶标仪562nm波长条件下进行蛋白定量，蛋白含量采用BCA试剂盒检测。定量后的蛋白样品取10μL进行上样，采用8%～15%的SDS-PAGE分离胶进行蛋白电泳，PVDF膜转膜2h，室温下用5%脱脂奶粉进行封闭1h，用ECL化学发光显影，凝胶成像系统检测NLRP3、p-NF-κB、CASPASE-1、IL-1β、IL-18、NE蛋白的表达变化。

1.2.5 肺组织病理损伤观察

取各组小鼠右肺中叶组织，迅速放入4%多聚甲醛液中固定，脱水，石蜡包埋，切片，然后用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，光学显微镜下观察。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 各组小鼠临床表现

CON组小鼠活动状态正常，正常摄食、正常饮水。模型组在腹腔注射LPS 12h时，出现步态蹒跚、精神萎靡、呼吸浅快或深快、节律不齐，时有呼吸困难、眼神涣散。小鼠均存活，无死亡。

2.2 肺含水量比较

与CON组相比，LPS组小鼠肺W/D升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+SV组显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)；LPS+OLT组与LPS组比较有所下降，但无统计学差异(P>0.05)。见图1。

与CON组比较，*P<0.05；与LPS组比较，#P<0.05

2.3 肺组织中炎症因子IL-1β含量的比较

ELISA法测定结果显示，与CON组比较，LPS组IL-1β表达水平显著升高(P<0.05)；LPS+SV组IL-1β表达水平较LPS组高，而LPS+OLT组IL-1β表达水平较LPS组低(P<0.05)，作用与CON组相当(见图2)，此结果表明，SV不能够抑制NLRP3炎症小体下游的炎症因子IL-1β的释放。

与CON组比较，*P<0.05；与LPS组比较，#P<0.05

2.4 SV对NE蛋白的影响

如图3所示，Western blotting结果显示：与CON组相比，LPS组中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)表达显著性增多(P<0.05)；SV作为一种选择性中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，与LPS组相比较，能够显著性抑制NE的表达(P<0.05)，且治疗作用与CON组相当；而NLRP3炎症小体抑制剂并没有降低NE的表达。

与CON组比较，*P<0.05；与LPS组比较，#P<0.05

2.5 SV对p-NF-κB蛋白的影响

Western blotting法检测各组小鼠肺组织中的p-NF-κB蛋白表达变化，结果见图4。与CON组比较，LPS组p-NF-κB蛋白表达明显增多(P<0.05)；与LPS组相比，LPS+SV组p-NF-κB蛋白表达明显减少(P<0.05)；同时，OLT 1177作为NLRP3炎症小体特异性抑制剂，抑制了p-NF-κB蛋白表达，但统计学上无意义(P>0.05)。

与CON组比较，**P<0.01；与LPS组比较，##P<0.01

2.6 SV对NLRP3炎症小体相关蛋白的影响

Western blotting法检测各组小鼠肺组织中NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、CASPASE-1、IL-18以及IL-1β的表达情况，结果如图5所示。与CON组相比，LPS组NLRP3蛋白表达显著性增多(P<0.01)，CASPASE-1、IL-18以及IL-1β蛋白表达均显著性增多(P<0.05)；与LPS组相比，LPS+SV组中NLRP3蛋白表达明显下调(P<0.001)、CASPASE-1蛋白表达明显减少(P<0.05)、IL-18蛋白表达显著性降低(P<0.01)、IL-1β蛋白的表达变化并没有降低(P>0.05)，LPS+OLT组中的IL-1β蛋白表达显著性降低(P<0.05)。此结果说明，SV能够部分抑制NRLP3炎症小体的活化。

与CON组比较，**P<0.01；与LPS组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

2.7 SV对LPS诱导的小鼠肺组织病理学改变的影响

光学显微镜下观察，HE染色结果显示(图6，封二)：CON组肺泡结构清晰完整，无异样；LPS组出现明显病理学改变，包括炎性细胞浸润、肺泡水肿、肺泡壁增厚以及肺泡紊乱；而LPS+SV组以及LPS+OLT组明显抑制了肺组织的病理学改变。

3 讨 论

急性肺损伤是指在严重感染、创伤、烧伤、休克等各种致病因素下诱发的急性、进行性呼吸功能不全等症状，其主要病理改变为肺泡-毛细血管通透性增加、炎性细胞聚集，临床上会出现明显的呼吸窘迫以及顽固性低氧血症。因其发病机制极为复杂，急性肺损伤仍然是现代危重病医学的重大难题，目前尚无有效的治疗方法。

据报道[7]，炎症在ALI中起着关键作用，炎症小体是炎症相关疾病的重要治疗靶点。炎症小体是由多种蛋白质组成的复合体，其中NLRP3炎症小体是当代研究热点之一，可以被细菌脂多糖(LPS)、K+外流、Ca2+信号、活性氧(ROS)、线粒体功能障碍和溶酶体破裂等多种成分活化[8]。NLRP3受体蛋白含有PYD、NACHT、LRR三个结构域。当激动剂接触受体蛋白时，NLRP3的PYD结构域与ASC的PYD结构域结合，进而ASC中的CARD结构域与效应蛋白CASPASE-1的CARD结构域结合，从而活化NLRP3炎症小体，释放IL-1β和IL-18，诱导免疫细胞的浸润及其他细胞因子的产生，导致相应组织发生炎性损伤[9]。相关研究[10]表明，通过生物信息学预测，含有3 (NLRP3)的类节点受体被认为是miR-495的一个可能靶点，miR-495启动子的甲基化可以抑制miR-495的表达，过表达miR-495可以抑制NLRP3炎性小体的激活，最终抑制LPS诱导的ALI的发展。Zhang 等研究[11]显示，在发生急性肺损伤的小鼠体内，NLRP3炎症小体被显著激活并释放了大量的IL-1β和有活性的CASPASE-1，褪黑素能够通过抑制细胞外组蛋白而抑制NLRP3炎症小体的激活；Cao等[12]认为，促红细胞生成素可以通过抑制EPOR/JAK2/STAT3信号通路有效抑制NLRP3炎症小体活化来减轻LPS诱导的急性肺损伤；枸杞多糖通过介导SIRT1抑制NLRP3炎症小体的活化而减轻高氧诱导的急性肺损伤[13]。以上研究充分证明了抑制NLRP3炎症小体的活化是治疗急性肺损伤的关键。本研究结果显示，在LPS诱导的急性肺损伤小鼠体内，NLRP3、CASPASE-1等蛋白表达明显增多，NLRP3炎症小体明显被活化，释放的IL-18以及IL-1β介导了急性肺损伤的发生发展。应用NLRP3特异性抑制剂预处理后，显著降低了NLRP3、CASPASE-1、IL-18以及IL-1β等炎症小体相关蛋白的表达，进一步改善了肺组织的炎症浸润，从而对急性肺损伤起到保护作用。

作为中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，SV可竞争性抑制中性粒细胞的活化，减少急性呼吸窘迫综合征过程中的中性粒细胞浸润，从而对肺部起到保护作用[14]。近年来，国内外多个动物肺损伤模型均表明SV对肺损伤有保护作用，主要机制是减少肺泡中以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润，抑制NE产生，并改善肺损伤的症状[15-16]，但其与NLRP3炎症小体的作用尚未明确。本研究结果提示，SV能够显著降低LPS引起的肺损伤小鼠的湿干比，明显改变肺组织的炎症浸润、中性粒细胞聚集等病理学改变，抑制肺组织中p-NF-κB、NLRP3、CASPASE-1、IL-18以及NE蛋白的表达水平，对LPS诱导的急性肺损伤起到保护作用，但不能减低肺组织中IL-1β蛋白的表达水平。这些结果表明，SV作为中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，能够抑制NF-κB介导的p-NF-κB/NLRP3/CASPASE-1/IL-18通路，部分缓解急性肺损伤引起的NLRP3炎症小体活化。

综上所述，SV不仅能通过抑制中性粒细胞弹性蛋白酶的作用来减轻LPS诱导的急性肺损伤，还能通过部分抑制NLRP3炎症小体活化而缓解急性肺损伤引起的炎症作用。