超声造影评价小鼠三阴性乳腺癌模型特征及EGFR靶向治疗效果

孝梦甦，朱庆莉，赵辰阳，李建初，吕 珂，冯海凉，刘玉琴，牛梓涵，罗焱文，姜玉新*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院超声医学科 协和转化医学中心，北京 100730；2.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院细胞资源中心，北京 100005)

乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤之一。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer， TNBC)指雌激素受体(estrogen receptor， ER)、孕激素受体和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2， HER2)均为阴性的乳腺癌，在乳腺癌中占比约为20%～30%。不同于其他亚型乳腺癌，TNBC侵袭力强、恶性度高、预后差、复发及转移率高[1]，肺、脑及骨转移率高，死亡率高，对传统化学治疗相对较不敏感[2]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor， EGFR)在TNBC中的表达程度明显高于其他亚型乳腺癌；约80% TNBC高表达EGFR[3]，而其他亚型中仅10%表达EGFR[4]，使得EGFR成为近年诊断及治疗TNBC的重要靶点之一[5-6]。本研究采用超声造影(contrast enhanced ultrasound， CEUS)动态观察小鼠TNBC模型不同阶段TNBC病灶及新生血管发展情况，评价EGFR通路靶向药物治疗TNBC的效果。

1 资料与方法

1.1 实验动物及主要材料 35只雌性非肥胖糖尿病及严重联合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency， NOD-SCID)小鼠，4～5周龄，体质量16～18 g，购自华阜康生物科技股份有限公司。EGFR通路抑制剂为司美替尼(Selleck公司)，磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K)选择性抑制剂为GDC-0941(Selleck公司)，人乳腺癌细胞MDA-MB-231、RPMI1640培养基及胎牛血清由国家实验细胞资源共享平台中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心提供。

1.2 构建模型 于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中复苏MDA-MB-231细胞，置于37℃、5% CO2培养箱内，每4～6天进行传代；待70%～80% MDA-MB-231细胞汇合度状态良好时收集细胞并计数，以1×107个细胞/只接种于5只小鼠右侧腋窝皮下。接种后33天处死小鼠，获取肿瘤组织并研磨制成单细胞悬液，以0.9%生理盐水调整细胞浓度至1×108个/ml；以1×107个/只接种其余30只小鼠左臀部皮下，随机分为靶向组及对照组各15只，并逐只编号。对靶向组于建模后第3、7、11及15天经腹腔注射联合药物(20 nmol司美替尼及20 nmol GDC-0941)，每只0.1 ml；对照组经腹腔注射等量生理盐水。

1.3 CEUS 采用Mindray Zonare超声诊断仪，线阵探头，频率18～30 MHz。分别于建模后第5、10、15及20天行超声检查，每次随机检查5只。由2名具有3年工作经验的超声科医师将凝胶垫置于小鼠腹部与超声波探头之间，以灰阶超声测量小鼠左臀部肿瘤体积，并观察其内部回声；以CDFI评价并记录病灶内部及周边血流信号；显示病灶最大切面，调节图像至最佳，切换进入谐波CEUS模式，采用声诺维(Bracco)加入5 ml生理盐水溶解，充分振荡至乳白色，形成微气泡混悬液，六氟化硫浓度45 μg/ml，以眶后静脉团注法将0.05 ml造影剂注入小鼠体内，储存120 s CEUS图像。根据增强达峰时病灶内造影剂分布将增强模式分为4型[7]：Ⅰ型，周边呈环状增强，内部无增强；Ⅱ型，周边呈环状增强，并向病灶内穿入；Ⅲ型，呈均匀或不均匀的弥漫性增强；Ⅳ型，周边呈环状增强，病灶内部呈结节状增强，意见存在分歧时经协商达成一致。以Philips SonoLiver软件绘制时间-强度曲线(time-intensity curve， TIC)，计算CEUS相关参数，包括病灶峰值强度(peak intensity， PI)、达峰时间(time to peak， TTP)及上升时间(rise time， RT)；每名医师测算3次，取平均值作为结果。

1.4 病理学 每次CEUS检查后随机处死每组3～4只小鼠(最后一日全部处死)，切取肿瘤组织，沿CEUS检查切面剖开肿瘤，于切面侧标记肿瘤方向，以10%多聚甲醛溶液固定标本。常规进行HE染色，以免疫组织化学检测EGFR及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)表达水平；以3D Hishtech Pannoramic 250扫描仪及Image-pro pus 6.0软件测量光密度(optical density， OD)值。

1.5 统计学分析 采用SPSS 21.0统计分析软件。以中位数(上下四分位数)表示不符合正态分布的计量资料，组间比较行Mann-WhitneyU检验；采用χ2检验或Fisher精确概率法比较组间CDFI及CEUS增强模式的差异。以Spearman相关性分析评价CEUS参数与病理学指标的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 常规超声 成功建立30只TNBC小鼠模型，成瘤率100%。建模后第5天，靶向组与对照组肿瘤体积无明显差异(P>0.05)；建模后第10～20天，靶向组肿瘤体积均明显小于对照组(P均<0.05)，见表1。

表1 不同时间点小鼠TNBC模型肿瘤体积比较

常规超声2组肿瘤均表现为边界清晰的低回声，内部多较均匀。靶向组7只CDFI 未见血流信号，8只内部或周边见条形血流信号；对照组3只未见血流信号，12只内部或周边见条形血流信号。组间小鼠TNBC病灶 CDFI表现差异无统计学意义(P=0.245)。

2.2 CEUS 靶向组Ⅰ型增强1只、Ⅱ型4只、Ⅲ型1只，Ⅳ型9只；对照组Ⅰ型2只、Ⅱ型2只、Ⅲ型2只、Ⅳ型9只；组间小鼠TNBC病灶 CEUS增强模式差异无统计学意义(χ2=1.333，P=0.721)。

建模后第5～20天，靶向组小鼠TNBC病灶PI均显著低于对照组(P均<0.05)；组间RT、TTP差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表2及图1、2。

图1 建模后第10天靶向组小鼠 A.灰阶超声可见边界清晰的低回声肿瘤； B.CDFI于肿瘤内部未见明显血流信号，周边可见条形血流信号； C.CEUS可见肿瘤周边呈环状增强，并向病灶内穿入(Ⅱ型)； D.TIC显示PI为269%

图2 建模后第10天对照组 A.灰阶超声可见边界清晰的低回声肿瘤； B.CDFI于肿瘤内部未见明显血流信号； C.CEUS可见肿瘤内部呈不均匀弥漫性增强(Ⅲ型)； D.TIC显示PI为8 440%

表2 不同时间点小鼠TNBC模型TNBC CEUS参数比较

2.3 病理学 建模后第10～20天，靶向组EGFR均显著低于对照组(P均<0.05)；建模后第5～20天，靶向组VEGF均显著低于对照组(P均<0.05)，见表3。

表3 不同时间点小鼠TNBC模型肿瘤EGFR及VEGF OD值比较

2.4 相关性分析 EGFR与VEGF具有相关性(r=0.629，P<0.001)；PI与EGFR及VEGF均具有相关性(r=0.679、0.839，P<0.001)；RT、TTP与EGFR及VEGF均无明显相关(P均>0.05)。

3 讨论

EGFR可促进肿瘤细胞增殖、侵袭及转移[8-9]。TNBC缺失其他亚型乳腺癌所具有的ER和HER2介导的通路，而EGFR通路对于TNBC发病具有至关重要的作用，相比不表达EGFR者，EGFR高表达TNBC患者预后差、转移率高、生存率低，治疗效果差[3]。本研究采用EGFR通路靶向药物阻断EGFR信号传导，以期达到靶向阻断肿瘤生长和新生血管生成的效果。

本研究以超声动态观察TNBC肿瘤生长情况及靶向药物治疗后的生长变化情况，发现初期(建模后第5天)2组肿瘤未见明显差异，而后期(建模后第10～20天)靶向组肿瘤体积明显小于对照组，提示靶向药物对肿瘤具有明显抑制作用。LIAO等[10]应用携带药物的纳米复合物靶向结合TNBC的EGFR，以靶向阻断EGFR通路，结果显示其可显著抑制肿瘤生长；而非TNBC低表达EGFR，EGFR靶向治疗对其无明显效果。上述研究及本研究结果均提示EGFR是治疗TNBC的重要靶点。

乳腺癌是典型的血管依赖性肿瘤，新生血管对TNBC的发生发展具有至关重要的作用。EGFR可增强血管生成因子表达，促进血管内皮细胞芽生、增殖。CEUS中将造影剂注入血管内，既可清晰显示肿瘤血管分布及走行，又能获得肿瘤血管功能参数，定量评估肿瘤微循环灌注。本研究应用CEUS动态观察不同阶段TNBC的血供变化，发现随时间延长，TNBC新生血管逐渐增多、PI逐渐增加；靶向阻断EGFR通路后，PI显著低于对照组；病理结果显示，靶向组TNBC的EGFR与VEGF表达均显著低于对照组。

本研究发现CEUS所测 PI与EGFR、VEGF均具有相关性，其变化趋势一致；EGFR与VEGF亦相关。EGFR能刺激平滑肌细胞分泌VEGF，进一步促进肿瘤新生血管生成。EGFR介导的信号传导在血管生成中具有重要作用，阻断EGFR通路可有效降低VEGF表达，减少TNBC新生血管生成。

综上所述， CEUS可动态评估小鼠TNBC病灶及血管生成，可视化及量化TNBC生长过程中新生血管的变化，为评估靶向治疗TNBC效果提供影像学依据；靶向阻断EGFR通路可有效缩小TNBC肿瘤体积、降低CEUS PI及EGFR、VEGF表达水平。本研究CEUS采用眶后静脉注射法，小鼠较难耐受，导致各时间点小鼠样本量较小，有待进一步完善。