circRNA在急性髓系细胞白血病中的应用进展*

吕定丰，应琪明，牧启田(1.宁波大学医学院研究生部，浙江宁波 315211；2.宁波市第一医院 a.输血科，b.干细胞移植实验室，浙江宁波 315010)

急性髓系细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)是以未成熟的髓系细胞异常增殖和分化受阻为特征的侵袭性血液肿瘤，约占急性白血病的70%～80%。依据细胞形态学、免疫标记、遗传学等特点，AML可分为不同亚型，具有高异质性。尽管近些年AML治疗已经取得惊人的进展，然而仍有相当部分患者容易复发、总体无病生存率较低[1]。AML的发病机制尚未明确，近年来，随着基因分析技术及测序技术的发展，人类相继发现了大量在AML发生、发展过程中具有重要作用的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)，这些ncRNA特异性作用于转录因子或作为影响表观遗传机制的关键组分，为诊断和预后标记AML提供了新的思路。环状RNA(circRNA)是近年来表观遗传学的研究热点，大部分circRNA参与转录和转录后基因表达的调控，现有证据证实，circRNA在各种血液恶性肿瘤的发生、发展、转移和治疗中均具有重要作用[2]。本文重点阐述circRNA在AML发生、发展、治疗和预后中的作用，为AML的诊断和治疗提供新的思路和认知。

1 circRNA的形成与特点

circRNA是一类特殊的ncRNA，通过非经典反式剪切形成3′端和5′端首尾相连的环状单链RNA。circRNA不仅是mRNA剪接的副产物，而且是一种新型调控选择性剪接的产物，在正常细胞分化和组织稳态以及疾病发展过程中均具有重要作用。

依照组成形式的不同，circRNA可分为外显子circRNA(ecircRNA)、内含子circRNA、同时含有外显子和内含子circRNA(exonintron circRNA,EIcirNA)及基因内circRNA(intragenic circRNA)。circRNA大部分存在于细胞质中，少部分存在于核酸中。目前已知的circRNA具有以下特点：(1)相对于线性RNA，其表达具有多样性，在人类基因中存在表达尤为普遍；(2)半衰期长，具有高度的稳定性；(3)具有物种特异性、组织特异性、进化保守性；(4)表达丰度与发育阶段、年龄和疾病类型密切相关。circRNA的存在形式和特点，使其成为疾病诊断和治疗过程中潜在的生物学标志物和治疗靶点[3]。

2 circRNA的功能

2.1作为microRNA(miRNA)海绵体，竞争抑制miRNA的功能 人们最先在斑马鱼实验中发现，小脑变性相关蛋白1反义转录物(cerebellar degeneration-related protein 1 antisense,CDR1as)具有超过70个miR-7结合位点，CDR1as表达过高或敲除miR-7均会造成中脑体积缩小，从而导致中脑发育障碍[4]。后经研究证实，circRNA可通过阻断miRNA与特定基因3′UTR的结合，间接调控基因表达，发挥海绵样作用[5]。

2.2调节选择性剪接 circRNA可以通过隔离翻译起始位点以调节蛋白质表达，从而起到mRNA“陷阱”的作用。Ashwal-Fluss等[6]研究发现，甘露糖结合凝集素(MBL)等剪接因子可调节circRNA的发生，并调节典型剪接与选择性剪接之间平衡。

2.3调节RNA与蛋白质之间的相互作用 在某些条件下，RNA结合蛋白(RBP)可以作为circRNA形成的激活剂或抑制剂。QKI蛋白和ADAR蛋白属于RBP的STAR家族，QKI通过与circRNA侧翼的内含子结合，促进环状结构的形成以调节circRNA产生，ADAR则通过降低环状结构的形成，减少circRNA的产生[7]。

2.4部分翻译为蛋白质发挥功能 Abe等[8]报道大肠埃希菌无细胞系统中的circRNA可以通过滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)机制进行高效翻译。Legnini等[9]报道circ-ZNF609可以直接编码蛋白质，参与肌肉发育过程。随后，又陆续有多种circRNA被证实具有翻译成蛋白质的功能。上述发现进一步扩展了人类对于circRNA功能的认知。

3 circRNA在AML中的应用

circRNA在造血细胞中广泛表达，且其表达水平可随分化而改变，并具有细胞类型特异性，是造血细胞分化、成熟和功能的调节因子。circRNA不仅参与AML等血液肿瘤的发生、发展和预后过程，而且在血液肿瘤细胞中的表达谱相比正常细胞更为多样，在发展不同阶段影响造血细胞的蛋白质表达水平。

3.1circRNA参与AML发病机制

3.1.1通过circRNA-miRNA网络参与AML发病 Chen等[10]对新发AML和缺铁性贫血(IDA)患者进行circRNA微阵列分析，发现AML患者中有282个circRNA上调，416个circRNA下调。其进一步通过实时荧光定量PCR(real time-quantitative PCR，RT-qPCR)对87例AML和45例IDA患者的队列进行分析，证实AML患者中circ-ANAPC7显著上调。circ-ANAPC7富含hsa-miR-181家族miRNA应答元件，利用KEGG富集分析预测显示，circ-ANAPC7可能与hsa-miR-181家族结合参与AML的发病。也有学者对AML和IDA患者的样本进行了RNA测序技术(RNA sequencing,RNA-seq)检测，结果发现circ_0009910在AML患者骨髓中明显上调，高表达的circ_0009910通过“吸附”miR-20a-5p促进了细胞增殖，加速AML发生和进展[11]。

有学者[12]用生物信息学和荧光素酶分析证实，miR-203可结合circ_100290和Rab10，敲除circ_100290后能够显著阻滞G1期细胞周期，促进细胞凋亡，并增加了细胞周期蛋白D1、CDK4、BCl-2和caspase-3的表达水平，提示circ_100290通过“吸附”miR-203调控AML细胞增殖和凋亡。

3.1.2f-circRNA与AML 肿瘤细胞基因组的不稳定性会引起染色体易位，导致非同源染色体重排，形成融合基因组。融合基因经常发生在白血病和实体肿瘤中，是重要的肿瘤标志物。在AML中，t(15;17)易位形成PML-RARa，而t(9;11)易位形成MLL/AF9，在PML/RARα和MLL/AF9融合基因形成过程中分别会形成衍生物f-circPR和f-circM9，这些f-circRNA与线性融合基因共同在急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)或其他亚型AML发生、发展过程中发挥了重要作用[13]。Greene等[14]发现敲除f-circM9和f-circPR可逆转t(9;11)和APL的细胞表型，诱导细胞凋亡，提高对砷剂或阿糖胞苷药物敏感性。以上研究结果提示，f-circRNA参与了AML发生和进展。

3.2circRNA表达谱与AML亚型密切相关 核磷蛋白基因(NPM1)是AML最常见的突变基因之一。NPM1具有原癌基因和抑瘤特性，通过编码多功能伴侣蛋白参与核糖体的生物合成、凋亡和细胞增殖。在AML中，NPM1基因第12外显子突变导致HOX基因家族异常表达，从而促进白血病的发生[15]。Hirsch等[16]检测了NPM1野生型和突变型AML患者中的circRNA，并对健康人对照组和AML患者中circRNA的表达进行了整体评估，结果显示47.9%的高表达基因存在circRNA转录。其通过RNA-Seq分析发现，circ_0075001表达与NPM1表达呈正相关，分化成熟较差的M0和M1亚型circ_0075001的表达水平明显高于分化成熟较好的M2、M4和M5。由此可见，circ_0075001表达水平与分子亚型和细胞分化成熟阶段密切相关。进一步研究显示，circ_0075001的高表达与Toll样受体(TLR)信号通路相关基因呈现负相关。TLR不仅是先天免疫应答的重要组成部分，也与AML患者白血病干细胞的存活分化中TLR1/TLR2通路的激活有关。而Marcucci等[17]研究表明，TLR信号通路基因的表达与AML中miRNA-181家族成员的表达水平呈负相关。由于NPM1基因包含miR-181的结合位点，因此可以推断，NPM1可与miR-181家族成员相互作用，从而影响TLR信号通路相关基因的表达。

为了诊断和区分APL患者和正常核型AML患者，有学者[18]使用Acfs工具(accurate circRNA finder suite)分析了AML circRNA谱，结果发现不同分子亚型AML呈现特异性circRNA表达谱，表明运用circRNA表达谱可以鉴别AML特殊亚型。HIPK2是核内转录激活因子，在AML的形成和发展过程中具有重要作用，而circ-HIPK2与APL细胞分化密切相关。Li等[19]研究表明，与正常对照及其他亚型AML相比，APL细胞中circ-HIPK2的表达水平明显减低，但经全反式维甲酸诱导分化后，circ-HIPK2表达水平又迅速升高，因此circ-HIPK2可以作为APL亚型标志物。

3.3circRNA与AML的诊断 Yi等[20]研究发现，circ-VIM在AML中的表达水平较健康人对照组明显升高，且与白细胞计数呈正相关；ROC曲线分析显示，circ-VIM可作为AML患者与健康人鉴别诊断的生物学标志物。该circ-VIM表达不仅可以准确区分AML、非APL AML和正常核型AML，而且其高表达能预示患者无病生存期和总生存期较短，也是1个独立的预后不良因素。

Li等[21]对有髓外浸润(EMI)和无髓外浸润的AML患者以及健康志愿者同时进行了circRNA微阵列分析，结果显示，与非EMI患者相比，EMI-AML患者有253个circRNA和663个基因明显上调，259个circRNA和838个基因明显下调。其进一步与健康对照者的circRNA表达谱比较发现，circ_0004277是AML患者最显著下调的circRNA之一，可以将AML患者与健康个体进行区分。因此，circRNA在AML中具有丰富的特异性，也可作为AML潜在诊断标志物。

3.4circRNA可预测AML的耐药和预后 Li等[21]研究结果显示circ_0004277在正常核型AML患者中的表达显著减低，化疗缓解后其表达水平恢复正常，而复发时其表达水平又迅速减低，提示circ_0004277也可作为监测AML病情检测的重要指标。

化疗耐药性是影响AML患者生存的重要原因之一。Shang等[22]利用高通量芯片比较了THP-1和阿霉素耐药THP-1(THP-1/ADM)细胞系的circRNA表达谱，结果显示49个circRNA在THP-1/ADM细胞系中呈异常表达，circ-PAN3在难治性/复发性AML患者中明显上调，并证实该circRNA通过circ-PAN3-miR-153-5P/miR183-5P XIAP轴驱动AML耐药。

FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase-3,FLT3)基因已被证实与AML预后密切相关，无FLT3-ITD或伴有FLT3-ITD低频率突变预后良好，而伴有FLT3-ITD高频率突变预后不良[23]。近期，有学者采用qPCR检测证实，与非FLT3-ITD-AML患者相比，FTL3-ITD-AML 患者circMYBL2表达明显上调。其进一步研究证实，cirMYBL2可与RNA结合蛋白PTBP1结合，协助后者与FLT3/FLT3-ITD的相互作用，增强FLT3/FLT3-ITD的翻译，从而促进AML的进展。相反，circMYBL2敲除后可抑制FLT3-ITD-AML的进展，并降低FLT3-ITD-AML患者的化疗耐药[24]。

4 circRNA的检测方法

自circRNA发现以来，人们已经开发出各种工具验证特定circRNA的存在，每种技术都有其各自的优缺点。

4.1Northern blot Northern blot是检测circRNA存在、大小和丰度最有说服力的方法，是检测circRNA的金标准[25]。特异性circRNA的检测可以通过跨越环状剪切区域的短探针或者覆盖整个环状外显子的长探针来完成，利用核糖核酸酶R(RNase R)降解线性RNA，探针与未被降解的circRNA结合。但是核小RNA(small nuclear RNA,snRNA)和组蛋白mRNA对RNase R具有天然抗性，有20%以上高表达的线性RNA不能被降解。因此，Xiao等[26]改良了RNase R纯化circRNA的方法，在RNA末端添加poly(A)尾及使用Li+取代缓冲液中的K+，使mRNA被降解，从而能更有效地检测circRNA。然而，Northern blot操作费时费力，并且使用放射性标记的探针，不适用于中高通量筛选工作，不过，对于1个或几个确定的circRNA的综合分析，它提供了一种非常有价值的方法。

4.2逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) 以RT-PCR为基础，利用引物反向剪接位点(backsplice junction，BSJ)两侧上、下游的引物检测circRNA，通常是验证circRNA的首选方法。RT-qPCR可用于鉴定差异表达的circRNA的定量研究。微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是通过阳性液滴和阴性液滴的比率来决定circRNA的绝对浓度，不受滚环效应影响，ddPCR可对circRNA进行真正意义上的绝对定量分析[27]。ddPCR在circRNA定量方面比RT-qPCR更为准确，特别在血浆等circRNA含量较少的样本检测方面，优势更为明显。但是，ddPCR需要专门的设备且成本不菲。

4.3NanoString数字化基因检测技术(NanoString technologies nCounter Analysis) 该技术基于单分子荧光显微镜计数的原理，适用于大量circRNA的筛选。针对所检测circRNA的BSJ，分别设计特定生物素标记的捕获探针和报告探针，每个探针的靶序列正好是50个核苷酸。该技术不需要使用酶，不存在与PCR扩增或cDNA合成相关的人为错误，且可同时筛选多达800个circRNA，隔夜杂交后，结果可在大约6 h完成。NanoString technologies nCounter有望成为circRNA检测新的金标准[28]，但和ddPCR类似，该技术需要特定设备，检测成本较高。

4.4RNA测序(RNA-seq) RNA-seq是发现新circRNA的首选方法[29],该方法将RNA逆转录成cDNA，通过对其建库、测序，获得相应circRNA的结构、序列及表达量。其优点是有较高的敏感性、准确性及相当高的通量，并可以发现新的circRNA，但它的成本很高，分析需要足够的计算能力和生物信息学专业知识。

4.5基因芯片 基因芯片技术对生物信息学专业知识需求较少，是检测circRNA的另一种可行方法[30]。该技术将大量探针分子固定在支持物上，与目标circRNA进行杂交，通过检测杂交信号强度获取数据，它可以一次性对大量circRNA进行检测和分析，从而解决传统Northern blot费时费力、通量小等不足。但该方法同样成本不菲，且只能检测已知circRNA。

5 小结及展望

circRNA具有普遍、稳定、特异等特点，并在AML等白血病形成和发展过程中具有重要作用，circRNA在血液、体液中可稳定检测，对于AML等血液肿瘤来说，具有得天独厚的优势，不仅可运用于AML诊断和分型诊断，还可用于监测AML的疗效和预测风险。新circRNA的不断发现，circRNA新的生物学作用的不断揭示，为人类认识和攻克AML提供了新的思路和可能。当然，人们对于circRNA的真正认知才刚刚起步，circRNA在AML中如何进行调控，哪些circRNA能为哪些亚型AML提供精确诊断、准确预测预后以及有效治疗靶点，解决这些问题，仍需要将来广泛而深入地探索。