miR-21-5p 在口腔黏膜下纤维化癌变细胞中的表达及生物信息学分析

胡兆勇 谭 劲 陈 明 杨庆泽 刘艳丽

1.湖南中医药大学医学院解剖实验中心，湖南长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院口腔科，湖南长沙 410007；3.湖南中医药大学医学院，湖南长沙 410208

微RNA（microRNA，miRNA）是真核生物中广泛存在的一种长为21～25 个核苷酸的非编码RNA 分子。miRNA 可以通过特异性地结合到mRNA 的3’非翻译区，抑制mRNA 的翻译或直接断裂靶标mRNA。目前已被发现的人类miRNA 超过1400 种，其中miR-21 在肺癌、乳腺癌、口腔癌等的组织中高表达[1-3]。经研究发现其与肿瘤、细胞纤维化的发生发展密切相关。研究表明，miR-21 在口腔黏膜下纤维化组织中高表达[4]，但与口腔黏膜下纤维化癌变机制的关系尚不清楚。基于此，本研究构建口腔黏膜纤维化癌变细胞模型，初步探讨miR-21-5p 的表达情况，并通过生物信息学分析预测miR-21-5p 的靶基因及进行GO、KEGG分析，旨在为进一步研究miR-21-5p 与口腔黏膜下纤维化癌变的作用机制奠定理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠原代口腔黏膜上皮细胞由上海赛百慷生物科技有限公司提供，货号为RAT-iCell-m013，槟榔提取物由深圳润慧生物科技有限公司提供。荧光定量PCR 仪由美国Thermo Quant 公司提供，型号为Studio1，台式冷冻离心机由中国湖南湘仪公司提供，型号为H1650R；电泳仪由中国北京六一公司提供，型号为DYY-2C。

1.2 研究方法

1.2.1 培养细胞 将原代大鼠口腔黏膜上皮细胞按常规方式培养，选取对数期生长的细胞，将细胞悬液浓度调整为105个/ml，接种于12 孔板中，每孔接种400 μl，将12 孔板放在细胞培养箱中静置24 h，待细胞贴壁并达到一定融汇度后，弃掉上清液，磷酸盐缓冲液清洗，分为正常对照组和实验组，每组3 个孔实验组加入50 μg/ml 槟榔提取物诱导，构建口腔黏膜下纤维化癌变细胞模型。

1.2.2 RT-qPCR 检测miR-21 的表达 在网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/24720 上搜索目的基因，采用Primer5 软件设计引物，由上海生物公司合成引物。引物设计：目的基因序列在下面链接上搜索，Primer5 软件设计引物，上海生物公司合成引物。正向引物：5’-GCCTACAGCCATACCACCCGGAA-3’。反向引物；5’-CCTACAGCACCCGGTATCCCA-3’。产物长度116 bp。rno-miR-21-5p：5’-CGCCGTTCCTAGCTTATCAGAC-3’。PCR 管中分别加入如下试剂：cDNA 模板2 μl，2×SYBGREEN PCR Master Mix 15 μl，正向引物（10 μmol/L）1 μl，反向引物（10 μmol/L）1 μl，ddH2O 11 μl，共30 μl。用移液枪吸打混匀后，将其分装至3 个新的PCR管中（即每样本检测做3 个复孔），置于RT-qPCR 仪中进行PCR 反应。PCR 反应程序为：95℃10 min；95℃10 s，60℃30 s，重复40 个循环。所得结果采用2-ΔΔCt 法进行计算分析。

1.2.3 miR-21-5p 生物信息学分析 在靶标预测合集网站（http://ophid.utoronto.ca/mirDIP），利用miRDB、TargetScan 等30 个数据库预测miR-21 的靶基因，为减少假阳性率，选取分数是所有预测基因中TOP1%并存在于至少9 个以上数据库的靶基因。将预测的hsa-miR-21-5p 靶基因集合集进行GO 和KEGG 分析。GO 功能富集分析结果以气泡图展现，横轴代表基因比，纵轴为富集术语，原点的颜色从绿至红代表校正P 值越来越小，原点的大小代表相关基因的数量。GO 分析包括生物过程、细胞组成、分子功能，利用g-profiler 软件进行GO 注释分析。KEGG 通路分析时利用Fisher Exact Test 计算P 值，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组miR-21-5P 表达情况比较

实验组miR-21-5p 的表达明显高于正常对照组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见表1。

表1 两组miR-21-5p 表达情况

2.2 miR-21-5p 的靶基因预测结果

预测得到miRNA-21 的靶基因共994 个，其中综合得分排前三的是Smad7、PLAG1、TGF-β1。见表2。

表2 miR-21-5p 靶基因预测（仅展示部分结果）

2.3 miR-21-5p 靶基因GO 分析结果

在生物过程中miR-21-5p 靶基因主要富集于细胞大分子代谢过程、细胞代谢过程的调节等。见图1。在细胞组成层面，miR-21-5p 靶基因主要富集于细胞内细胞器、细胞质、细胞内膜结合细胞器等GO 条目中。见图2。在分子功能层面，靶基因主要富集于蛋白质、DNA、酶聚集等GO 条目中。见图3。

图1 miR-21-5p 靶基因的 GO-生物过程气泡图

图2 minR-21-5p 预测靶基因的 GO-细胞组成气泡图

图3 miR-21-5p 靶基因的 GO-分子功能分析图

2.4 miR-21-5p 靶基因集KEGG 通路分析结果

KEGG 分析发现靶基因主要富集于以下生物学通路中，分别为癌症相关通路、MAPK 信号通路、TGF-β 通路等。见图4。

图4 miR-21-5p 靶基因 KEGG 气泡图

3 讨论

口腔黏膜下纤维化是一种慢性隐匿性癌前病变[5-6]，主要病理过程为成纤维细胞增生、胶原堆积，临床表现为口干、进食灼热感、张口受限等不适[7]。流行病学调查表明口腔黏膜下纤维化发病与咀嚼槟榔有关[8]。随着全世界咀嚼槟榔人数逐渐增多，口腔黏膜下纤维化发病率日渐上升，口腔黏膜下纤维化癌变率也逐渐增加[9]。因此，研究口腔黏膜下纤维化癌变的发生机制，寻找有效治疗方法具有重大意义。

miR-21 作为一种癌基因，已经被证实在多种肿瘤组织中高表达。miR-21 在口腔鳞癌中的表达比口腔黏膜下纤维化更高，且其表达量与临床分期相关[3,10]。最近一项研究表明，循环miR-21 可作为检测口腔癌的潜在生物标志物[11]。miR-21 与纤维化密切相关[12]，研究发现miR-21 在口腔黏膜下纤维化组织中的表达上调，且是由TGF-β 通路介导的[4]。本研究结果显示，口腔黏膜下纤维化癌变细胞中的miR-21-5p 表达量明显高于正常细胞。综上所述，推测miR-21 可能与口腔黏膜下纤维化癌变的发生发展密切相关，具体机制尚不清楚。

miR-21 生物信息学分析结果显示miR-21-5p靶基因综合得分排前三的是Smad7、PLAG1、TGF-β1；KEGG 分析发现靶基因主要富集于癌症通路、MAPK信号通路、miRNA 通路与蛋白聚糖通路、TGF-β 通路等。TGF-β 是目前公认最强的致纤维化因子[13]，与纤维化及癌变的发生发展密切相关[14]。在口腔黏膜下纤维化的发病机制中TGF-β 起主要作用，表现为3 种亚型及其受体mRNA 表达的增加[15]。在口腔黏膜下纤维化癌变组织和细胞中，其表达高于正常组织和细胞，并且与肿瘤的恶性程度和预后相关[16-17]。TGF-β信号介导与纤维化相关的miRNA 的表达，上调的miRNA 包括miR-21[18-19]。TGF-β 信号通路和miRNA通路显示出相互串话，Smad7 很可能就是介导串话的中间信号[18]。研究表明，沉默miR-21 可通过抑制TGF-β1/Smad7 信号通路减轻肝实质纤维化[20-24]，miR-21 调控TGF-β/Smad7 信号通路介导心肌梗死后纤维化[25]，miR-21/Smad7 信号决定TGF-β1 诱导的癌相关成纤维细胞形成[26]。Smad7 在口腔黏膜下纤维化和口腔鳞癌中的表达均显著上调并促进其发生发展[27]。

综合以上，本研究推测miR-21-5p 与口腔黏膜下纤维化癌变密切相关，且Smad7 可能串话miR-21-5p 与TGF-β 介导口腔黏膜下纤维化癌变。