他索沙坦对糖氧剥夺诱导人肾小管上皮细胞的影响及作用机制

刘秀娟 吴 豫 邹 鑫 余燕燕 耿燕秋 双 峰

1.解放军联勤保障部队第九〇八医院肾内科，江西南昌 330002；2.解放军联勤保障部队第九〇八医院检验科，江西南昌 330002；3.解放军总医院第三医学中心肾内科，北京 100039；4.解放军联勤保障部队第九〇八医院骨科，江西南昌 330002

他索沙坦是一种血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）受体拮抗剂，在临床上用于降低患者血压，消除体内炎症[1]。Toll 样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）是介导肾脏炎症及纤维化的重要调节因子，Ang Ⅱ能够促进肾小管上皮细胞中TLR4 的表达[2-4]。作为Ang Ⅱ受体拮抗剂的他索沙坦可能通过抑制TLR4 对肾脏纤维化起到调控作用。缺氧缺血是肾脏纤维化中导致细胞凋亡和炎症反应的重要原因之一[5-7]。糖氧剥夺细胞模型多被用于在细胞水平上模拟缺氧缺血损伤的过程，应用此模型可进行药物保护作用机制的研究[8-10]。本研究探讨他索沙坦对人肾小管上皮细胞（HK-2）损伤的保护作用和机制。

1 材料与方法

1.1 材料

HK-2 细胞购于美国模式培养物保藏所；他索沙坦（货号：B-WM831）购于上海贤鼎生物科技有限公司；α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白（Collagen Ⅰ，ColⅠ）、纤维粘连蛋白（Fibronectin）、E 钙粘蛋白（E-cadherin）、葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（C/EBPhomologousprotein，CHOP）、TLR4 和β 肌动蛋白（β-actin）一抗（货号分别为19245、72026、26836、8426、3177、D46F1、143585、8480），二抗（货号：704S）均购于美国Santa Cruz 公司；pcDNA3.1-TLR4 和空载质粒购于上海生工生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与分组 HK-2 细胞培养于含1%青链霉素、10%胎牛血清的DMEM/F12 培养液中。对照组为正常培养的细胞；糖氧剥夺组细胞培养于不含血清的无糖培养基，放置于2% O2，93% N2，5% CO2培养箱中培养；糖氧剥夺组的细胞培养液中加入终浓度分别为1、5、10、15 μmol/L 的他索沙坦进行培养组成不同浓度的他索沙坦药物组。培养48 h 后进行后续实验。

1.2.2 细胞增殖检测 细胞增殖检测采用MTT 法，操作步骤按照试剂盒说明书进行，用酶标仪测定490 nm的吸光度（optical density，OD）值。细胞增殖率=（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）。

1.2.3 细胞凋亡检测 HK-2 细胞分组处理48 h 后，用4℃预冷的PBS 将各组细胞洗涤2 次，随后加入含0.2% EDTA 的胰酶消化并收集细胞。加入1 ml 1×Annexin V 结合缓冲液，800 r/min 离心5 min 后弃上清，加入200 μl 结合缓冲液重悬细胞。悬液中加入5 mg/L 的Annexin V-FITC 10 μl 和碘化丙啶5 μl，混匀后37℃避光孵育30 min。最后以488 nm 为激发波长，530 nm 为发射波长，用流式细胞仪（Attune NxT，Thermo Fisher）检测细胞凋亡。

1.2.4 Western blot 实验 HK-2 细胞分组处理48 h后，用RIPA 细胞蛋白裂解液裂解各组细胞，提取细胞总蛋白，使用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。以β-actin 为内参，同等量蛋白经SDS-PAGE 电泳后，进行电转膜，加入待测蛋白一抗，4℃孵育过夜。漂洗后加入二抗，室温孵育1 h。用X 线曝光分析，结果用Image-Pro Plus 处理。

1.2.5 TLR4 过表达质粒的转染 取对数期生长良好的HK-2 细胞，用转染试剂LipofectamineTM3000 将TLR4 的过表达质粒pcDNA3.1-TLR4 或对照空载质粒pcDNA3.1 转染细胞48 h。Tas+pcDNA3.1-TLR4组：转染pcDNA3.1-TLR4 质粒后，细胞培养液中加入10 μmol/L 的他索沙坦并用糖氧剥夺培养；Tas+pcDNA3.1组：转染空载质粒后，细胞培养液中加入10 μmol/L 的他索沙坦并用糖氧剥夺培养。

1.3 统计学方法

采用Graphpad prism 5 软件统计分析。计量资料数据用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用Bonferroni 检验。以P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 他索沙坦对糖氧剥夺诱导的HK-2 细胞增殖的影响

糖氧剥夺组的细胞增殖率低于对照组（P ＜0.05）。1、5、10 μmol/L 他索沙坦组与糖氧剥夺组细胞增殖率比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。15 μmol/L 他索沙坦组细胞增殖率低于糖氧剥夺组（P ＜0.05）。后续实验中选取10 μmol/L 他索沙坦作为糖氧剥夺HK-2细胞的处理浓度。见图1。

图1 他索沙坦对糖氧剥夺诱导HK-2 细胞增殖的影响

2.2 他索沙坦对糖氧剥夺诱导HK-2 细胞凋亡的影响

糖氧剥夺组细胞凋亡率高于对照组（P ＜0.05）。他索沙坦组细胞凋亡率低于糖氧剥夺组（P ＜0.05）。见图2。

图2 他索沙坦对糖氧剥夺诱导HK-2 细胞凋亡的影响

2.3 他索沙坦对糖氧剥夺诱导的HK-2 细胞肾纤维化标志蛋白表达的影响

糖氧剥夺组α-SMA、ColⅠ和Fibronectin 蛋白表达高于对照组，E-cadherin 蛋白表达低于对照组（P ＜0.05）；他索沙坦组α-SMA、ColⅠ和Fibronectin蛋白表达低于糖氧剥夺组，E-cadherin 蛋白表达高于糖氧剥夺组（P ＜0.05）。见图3。

图3 他索沙坦对糖氧剥夺诱导的HK-2 细胞肾纤维化标志蛋白表达的影响

2.4 他索沙坦对糖氧剥夺诱导的HK-2 细胞内质网应激的影响

糖氧剥夺组GRP78 和CHOP 蛋白表达高于对照组（P ＜0.05）；他索沙坦组GRP78 和CHOP 蛋白表达低于糖氧剥夺组（P ＜0.05）。见图4。

图4 他索沙坦对糖氧剥夺诱导的HK-2 细胞内质网应激的影响

2.5 TLR4 过表达对他索沙坦减缓糖氧剥夺诱导HK-2 细胞损伤的影响

糖氧剥夺组TLR4 蛋白表达高于对照组（P ＜0.05）；他索沙坦组TLR4 蛋白表达低于糖氧剥夺组（P ＜0.05）。他索沙坦+pcDNA3.1-TLR4 组TLR4 表达高于他索沙坦组，细胞凋亡率高于他索沙坦组，α-SMA、ColⅠ、Fibronectin、GRP78 和CHOP 蛋白表达高于他索沙坦组，E-cadherin 蛋白表达低于他索沙坦组（P ＜0.05）。见图5。

图5 他索沙坦通过抑制TLR4 表达对糖氧剥夺诱导HK-2 细胞损伤的影响

3 讨论

临床上常用血管紧张素受体拮抗剂改善慢性肾病患者的病情，但是其治疗原理还未完全阐明[11-12]。他索沙坦是血管紧张素受体拮抗剂之一。本研究结果显示，糖氧剥夺处理显著抑制HK-2 细胞的生长，低浓度的他索沙坦对糖氧剥夺处理的HK-2 细胞没有毒性作用，本研究挑选了10 μmol/L 他索沙坦作为最适的处理浓度。他索沙坦抑制糖氧剥夺诱导的HK-2细胞凋亡。研究中常用α-SMA、ColⅠ、Fibronectin 和E-cadherin 作为组织纤维化的检测指标[13]。本研究结果显示，他索沙坦显著抑制糖氧剥夺诱导的HK-2 细胞中α-SMA、ColⅠ和Fibronectin 的蛋白表达，并促进E-cadherin 的蛋白表达。提示他索沙坦能够抑制糖氧剥夺诱导的HK-2 细胞损伤。

内质网应激和多种肾脏疾病的发展紧密相关[14-16]。GRP78 是内质网应激系统上游的开关分子[17-19]。CHOP是内质网应激相关细胞凋亡的重要调节分子[20-22]。本研究结果显示，他索沙坦显著抑制糖氧剥夺诱导HK-2 细胞中GRP78 和CHOP 的蛋白表达，提示他索沙坦有抑制糖氧剥夺诱导内质网应激的潜力。

肾脏纤维化的过程中伴随着持续的炎症[23]。TLR4作为炎症的重要调节因子，在肾病患者的病变组织、各类肾脏纤维化动物模型中呈现过量表达，成功抑制或敲除TLR4 可以减轻肾脏纤维化[24-25]。本研究结果显示，糖氧剥夺组TLR4 表达显著高于对照组，他索沙坦显著抑制了糖氧剥夺诱导的HK-2 细胞中TLR4的表达。过表达TLR4 后他索沙坦处理引起细胞凋亡减少，肾脏纤维化和内质网应激标记蛋白表达降低的作用被减弱，提示他索沙坦减缓糖氧剥夺诱导的HK-2 细胞损伤的作用是通过抑制TLR4 产生的。

综上所述，他索沙坦能够抑制糖氧剥夺诱导的HK-2 细胞凋亡和内质网应激，且其作用是通过抑制TLR4 的表达产生的，这些结果为今后他索沙坦在肾脏纤维化疾病治疗中的应用提供新的实验证据。