肿瘤相关成纤维细胞与肝癌的关系

胡 晓， 毛德文， 牙程玉

1 广西中医药大学 研究生学院， 南宁 530001； 2 广西中医药大学第一附属医院 肝病一区， 南宁 530023

原发性肝癌(简称肝癌)是一种恶性程度极高的肿瘤，其死亡率在我国乃至全世界的恶性肿瘤中位居前列。依据组织病理学可将肝癌分成3大类型：肝细胞癌(HCC)、胆管细胞癌(ICC)和混合型肝癌，其中HCC占比高达90%[1]。肝癌具有隐匿起病，进展迅速，治疗难度大的特点。鉴于肝癌对化疗并不敏感，目前临床多采用放疗、消融术、经肝动脉化疗栓塞术(TACE)、肝移植、手术切除等治疗方案，但治疗效果也往往不及预期。近年来，广大学者对各种癌症发生发展机制有了更新的认识，提出肿瘤微环境的概念[2]，认为肿瘤微环境有望为癌症治疗提供全新的靶位。肿瘤微环境包括数量众多的存在于肿瘤周围的细胞(间质细胞、免疫细胞以及内皮细胞等)，其中，隶属于间质细胞的肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts，CAF)占重要地位[3-4]。CAF存在于肿瘤间质中，由多种细胞分化而来，目前多数认为成纤维细胞(normal fibrolasts，NF)是其主要来源[5]，CAF的致癌作用已得到证实。在肝癌中，CAF通过激活各种途径(信号通路)、启动多种细胞因子表达参与肝癌细胞之间的串扰，干扰正常组织细胞之间的生存秩序，进而为肿瘤细胞提供适合生存发展的微环境[6]。越来越多的证据显示，CAF既可发挥促进肿瘤细胞形成、血管生成、侵袭转移的作用，又可能起到抑制肿瘤演变的积极影响。

1 CAF与肝癌的发生发展

1.1 CAF在肝癌生成和增殖中的作用 CAF可通过分泌多种促肿瘤形成的关键细胞因子(生长因子、炎性因子和趋化因子等)，以启动相关信号转导通路直接或间接对肿瘤的生成和增殖起作用。冯仁鑫等[7]在研究CAF对肝癌干细胞的作用时观察到，经CAF培养的肿瘤干细胞相较于对照组，其自我更新相关基因Oct4、Nanog、Klf4、Bmi1的表达上调明显，干细胞成球能力显著增高，由此可见，CAF可通过影响肿瘤干细胞的更新促成HCC。Li等[8]的实验也证实CAF释放肝细胞生长因子和IL-6细胞因子以激活STAT3磷酸化来增强了CD24+HCC细胞的干性，促进其成癌性。沙朦等[9]的CCK8实验发现人肝内胆管癌相关成纤维细胞培养基(iCAF-CM)中的胆管癌RBE细胞和HCC C9810细胞吸光度值均明显高于对照组, 证明肝内胆管癌细胞的增殖能力被iCAF提升。孙浩然等[10]探究了CAF与肝癌细胞株Huh7、HepG2之间的关系，结果在建立的体外CAF-Huh7和CAF-HepG2培养模型中检测到两种癌细胞株增殖能力的提升。Lau等[11]将源自HCC患者的癌细胞与CAF 1∶1混合异体种植到小鼠体内开展体内致瘤性实验，与单独癌细胞注射组相比，实验组表现出更强大的致癌潜力。并且发现CAF产生大量肝细胞生长因子，以c-Met/FRA1/HEY1为媒介，丰富肝肿瘤起始细胞(T-IC)的数量并对其进行调控。Deng等[12]的研究中，肝肿瘤相关成纤维细胞利用IL-6介导的STAT3，诱导从基质细胞衍生因子(stromal cell-derived Faceor，SDF)-1a/CXCR4途径吸引来的单核细胞分化为髓源性抑制细胞，由于髓源性抑制细胞的激活，人体抗肿瘤免疫反应减弱，促成了肝癌的发生。

1.2 CAF在肝癌血管生成、血管生成拟态中的作用 由于肝癌是高度血管化的实体瘤，所以针对其血管的研究显得尤为必要。研究表明，CAF通过释放促血管生成因子起到促进肿瘤新生血管形成的作用。Liu等[13]对63例HCC患者的肿瘤组织进行检测，发现血管内皮生长因子成员之一的胎盘生长因子(placental growth factor，PlGF)，在CAF和活化的肝星状细胞中高表达，而过度表达的PlGF又同肿瘤新生血管标志物(CD31、CD34和CD105)高度相关，由此分析CAF可分泌PlGF，这对肝细胞癌血管新生起到促进作用，并可能导致HCC患者的预后不良。Huang等[14]通过与非CAF组对照比较，研究CAF促进人脐静脉内皮细胞增殖和血管生成的机制，结果表明CAF可通过体内外血管内皮生长因子的分泌上调人脐静脉内皮细胞中zeste同系物2的增强子的水平，从而阻止血管抑制素1的表达，最终对人脐静脉内皮细胞的增殖和血管形成起作用，进一步证明了CAF在肝癌血管形成中的影响。卢逸等[15]和李艳等[16]的试验中，对20例、56例HCC患者肝癌组织及癌旁组织中的肝癌相关成纤维细胞(hCAF)和微血管密度(microvascular density，MVD)进行研究，在接近血管内皮细胞位置的癌血窦周围发现hCAF标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的高表达，并在低分化肝癌组织中检测到明显高于中、高分化癌组织的hCAF密度和MVD，表明越高表达的hCAF，越高的肿瘤MVD，分析hCAF可能在肿瘤血管新生中起促进作用。

血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)，有别于传统的血管生成模式，已被证实普遍存在于各种肿瘤中，肿瘤细胞在早期生长阶段可由这个通道获得丰富的血液灌注和营养，VM可成为肿瘤细胞侵袭转移的路径，并作为影响癌症预后的危险因素，与患者的生存率密切相关[17-18]。陶明珠等[19]检测了60例HCC患者的癌组织标本，对患者的 CAF表达率、VM表达水平进行分析，结果显示α-SMA+CAF的高表达和VM的形成同肿瘤的大小、Edmondson分级、临床分期有关联，证实了CAF通过某些机制参与促进了肝癌VM的形成，并推断两者之间存在正相关性。Yang等[20]通过向小鼠体内注射人HCC QGY-7703肿瘤细胞和CAF建立异体种植模型以研究CAF与VM形成之间的关系。在这项研究中，发现CAF的分泌因子TGFβ和SDF1通过提高肿瘤细胞中血管内皮-钙黏着蛋白，基质金属蛋白酶2和层粘连蛋白γ2的表达水平，促成了VM。进一步的研究发现，将miR-101注射至小鼠模型体内后，可阻断TGFβ和SDF1的信号通路，从而对CAF促VM的形成起到阻抑作用，或可为抗肿瘤提供新的思路。

1.3 CAF在肝癌转移侵袭中的作用 肝癌极易发生转移，且转移部位广泛，可大致分为肝内转移和肝外转移。肝内转移多为癌细胞直接侵犯或癌栓脱落形成病灶，肝外转移则包括血行、淋巴及种植转移，转移灶可达全身多处器官和组织。研究者们认为，被活化的CAF在肿瘤转移的过程中举足轻重，因此进行了大量的试验进行验证。华学锋等[21]观察了与hCAF体外共培养的肝癌细胞在96 h后的形态变化，结果发现MHCC97L-GFP肝癌细胞出现了播散样生长的变化，而HepG2-GFP肝癌细胞则发生了上皮细胞间质转型，由此得出hCAF能增强肝癌细胞转移侵袭的结论。在Fang等[22]的研究中发现CAF受到肿瘤细胞释放的外泌体miR-1247-3p的诱导而被活化，并且在伴有肺转移的HCC患者血清中检测到高于非肺转移HCC患者的miR-1247-3p表达水平，由此判断CAF在该外泌体的作用下与肝癌细胞之间发生串扰，与肝癌的肺转移密切相关，并分析这种相同的作用机制很可能也发生在肝癌的肝内转移中。Zhang等[23]分别对裸鼠静脉注射荧光素酶标记的MHCC97-H-miR-320a和MHCC97-H-NC细胞，28 d后，前者的6只小鼠中仅4只发生肺转移，而接受MHCC97-H-NC细胞注射的小鼠均出现肺转移，并对来源于人HCC的CAF外泌体进行测序，观察到CAF外泌体miR-320a较癌旁成纤维细胞表达有降低，分析源于CAF的外泌体miR-320a在CAF与肿瘤细胞之间充当“使者”，miR-320a的表达抑制促成HCC的转移。Sha等[24]从ICC患者的肿瘤细胞中分离出CAF、NF，并将ICC细胞HuCCT-1接种于条件培养基(CAF-CM、NF-CM)上，通过细胞数量计数发现侵袭性ICC细胞在CAF-CM中表现出更强大的侵袭转移能力。同时还证实α-SMA表达的CAF与ICC的淋巴结转移相关，Zhang等[25]的研究也佐证了CAF组织学表型中的未成熟表型与ICC的淋巴结转移紧密相关。武伟等[26]探讨了CAF与胆管癌细胞株RBE之间的关系，同样证实了CAF与胆管癌细胞增殖侵袭之间的正相关性，且发现CAF并不参与胆管癌细胞的凋亡。为评估CAF在体内外与HCC转移的关系，Liu 等[27]进行小鼠体内实验，观察到接种了肝癌细胞和CAF的小鼠(7/8)在脑、骨骼或肺中均出现HCC转移，转移率远远高于对照组；在体外CM试验中得出HCC细胞中Hh和TGFβ途径受到CAF分泌的CCL2、CCL5、CCL7和CXCL16趋化因子的激活而促成HCC转移的结论。

2 CAF在肝癌治疗中的潜力

肝癌极高的恶性程度、进展速度和复发概率导致了患者的高病死率，增加了其治疗难度，现有的治疗方案远不足以解决这一难题。近几年，科学家们开始认识到靶向调节CAF或可成为抗衡肿瘤有前途的治疗策略。Sun等[28]为了研究CAF衍生的旁分泌COMP是否受Resolvin D1的调节而对HCC干细胞起作用，利用补充COMP中和抗体的CAF-CM处理肝癌Hep3B和SMMC-7721细胞，结果发现，COMP中和抗体减弱了CMCAF诱导的上皮细胞间质转型进展和侵袭能力，并降低肿瘤细胞的增殖能力，证实RvD1可阻碍CAF的旁分泌COMP信号传导，对癌细胞的干性特征起到抑制作用。有学者[29]提出，CAF可通过诱导癌细胞的自噬，促进放射治疗后癌细胞修复，引起肿瘤复发，因此阻断癌细胞的自噬作用可能是克服肿瘤复发的新策略。Zhao等[30]对实验组CAF-CM组和对照组NF-CM组培养的肝癌Huh7细胞进行免疫荧光染色、蛋白质印迹检测，观察到CAF-CM组较对照组的Huh7细胞有更高的自噬水平，并采用自噬溶酶体抑制剂氯喹(CQ)对Huh7细胞进行处理，发现即使是经过CAF-CM共培养的癌细胞，其自噬作用也可被CQ有效抑制，并且表现出侵袭、转移能力的下降。有研究[31]表明，CAF的激活是可逆转的，Mertens等[32]的实验也证实了这一点，利用Navitoclax对CAA异体细胞移植大鼠模型进行治疗，研究治疗后大鼠肝脏，发现α-SMA表达减少，平均肿瘤-肝脏质量比降低，腹膜转移也有所减少，由此得出CAF可在Navitoclax的诱导下发生凋亡，足以在减小肿瘤大小、抑制转移方面起积极作用。Yu等[33]在对肝癌动物模型进行研究时提出，CAF在肝癌进程中可发挥免疫作用，可增加T淋巴细胞等免疫细胞的功能，在HCC中起有效促瘤作用，由此认为清除CAF或可增强肝细胞的抗肿瘤免疫力。

3 总结与展望

综上所述，CAF作为肿瘤周围细胞中的第二大类细胞，通过各种途径协同参与肿瘤细胞的增殖、侵袭转移及抗凋亡，在肿瘤微环境中所起的作用越来越突出。近年来，针对肿瘤微环境中各个组成部分的治疗策略备受瞩目，并取得了一定的成果，尤其是CAF相关的免疫疗法、靶向治疗等，成为对抗克服肿瘤的潜在诊断、治疗方案，但仍有许多不足亟待解决：(1)CAF来源的多样性决定了其异质性，甚至不同阶段的CAF在表型和功能上也呈现出差异，由此产生的差异在肿瘤的发生演变中或可起到不同的作用，因此如何精准确定CAF的来源和亚型，并采用相对应的CAF靶向药物对肿瘤进行精准干预是目前面临的难题[34]。(2)活化的CAF的促瘤性已得到证实，现发现CAF的活化与炎症、自噬等密切相关，为探寻更有效的抗肿瘤靶位，有待进一步深入研究CAF活化的病理机制，以及其同肿瘤细胞之间相互作用的分子机制[35]。(3)当前针对CAF的研究多数停留在体外实验或者动物实验，且研究数量有限，一方面，还需考量能否在人体内发挥相似的作用机制;另一方面，CAF靶向治疗相关药物的安全性尚不明确，还需开展更多的临床研究加以佐证。

作者贡献声明：胡晓负责拟定写作思路，撰写文章并最后定稿；毛德文教授负责对文章的知识性内容做批判性审阅；牙程玉参与文章修订。