威尔逊病患者结构脑网络的破坏*

殷红曦，朱龙 ，王艳昕

1 安徽中医药大学研究生院 安徽合肥 230031 2 安徽中医药大学第一附属医院脑病科 安徽合肥 230031

威尔逊病（Wilson’s Disease，WD）是一种铜代谢障碍常染色体隐性遗传性疾病，机体内过量的铜沉积在肝脏、大脑等多器官，可引起多种症状[1]。该病是由ATP7B基因纯合或复合杂合突变导致铜代谢障碍，有毒铜的积累最终导致氧化应激和细胞死亡[2]。在WD患者中，ATP7B功能缺陷导致肝细胞铜超载，并伴有肝病理改变。过量的铜也被释放到循环中，在其他组织中形成继发性的病理积累，尤其是大脑，会导致神经症状和精神障碍。

在过去的20年里，大部分关于威尔逊病的研究主要集中在基因及其表达和临床症状上。如McCann[3]等研究发现单核苷酸多态性具有可以调节ATP7B基因和机体铜状态的特性。Wang等[4]发现WD的长期标准化治疗可以有效地预防WD患者广泛的脑损伤并减少癫痫的发生。Helmy等[5]发现WD患者在疾病的任何时间点和d-青霉胺治疗期间均存在无症状性尿异常，早期干预可以阻止进展为肾功能不全。这可能是由于该病是罕见病以及检测手段的限制。然而近些年来，随着扩散张量成像（Diffusion tensor imaging，DTI）、静息态功能磁共振成像（Resting-state functional Magnetic Resonance Imaging，rs-fMRI ）和脑网络分析（Brain Network Analysis，BNA ）无创成像技术的迅速发展，一些研究者将其应用于WD的研究中。如王萍等[6]用磁共振扩散张量成像（DTI）技术评估肝豆状核变性（HLD）丘脑损害的价值时，发现DTI可在常规MRI 信号改变之前用于评估 HLD丘脑损害，并可提供扩散信息的变化。张发平等[7]采用DTI和MRS相结合的技术，对WD病脑组织损害的定量研究。

现阶段，使用现代的脑图谱技术基于图论的脑网络研究越来越多，如基于功能磁共振成像（fMRI）和弥散张量成像（DTI）技术的脑网络[8-10]研究。然而，以往的研究只关注大脑的局部变化，WD是否存在全局拓扑属性改变，这在很大程度上是未知的。并且临床上可见到有些WD患者出现记忆力、注意和计算等认知功能受损的情况，那么WD患者的认知情况与大脑网络的全局拓扑特性之间是否存在相关性，我们也不清楚。为了找出这些问题的答案，我们采集了20名WD患者和15名健康对照者的DTI数据，利用图论方法构建和分析结构脑网络，观察2组参与者大脑网络全局指标的组间差异。

资料与方法

1 诊断标准

WD的诊断是由2名有经验的临床神经病学家专家根据2008年AASLD《肝豆状核变性诊断和治疗指南》的共识确定的[11]。

2 入组标准

2.1 纳入标准 ①年龄13～45岁；②右利手；③首次诊断为WD病的患者或既往诊断为WD病但已经停止药物治疗1年以上者。

2.2 排除标准 ①有持续5min以上的意识障碍的头部外伤史；②有药物或酒精滥用史；③已怀孕史；④通过访谈和医疗记录审查诊断的任何身体疾病，如心血管疾病或其他神经系统疾病。

3 一般资料

本研究共纳入35例，包括20例WD患者和15例健康对照组。除此之外，所有参与者使用24项汉密尔顿抑郁量表（HAMD）[12]和14项汉密尔顿焦虑量表（HAMA）[13]诊断，排除焦虑和抑郁状态。HAMD是对受试者抑郁程度进行评分，当分数＞8分，表明可能有抑郁，则予以排除；HAMA是对受试者焦虑程度进行评分，当分数＞7分，表明可能有焦虑，则予以排除。蒙特利尔认知评估量表（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）[14]被用来评估患者的认知功能情况。本研究根据《赫尔辛基宣言》开展，并经安徽中医药大学第一附属医院医学研究伦理委员会批准，在对本研究进行完整的描述后，每个受试者都签署了书面知情同意书。

4 磁共振数据的采集

MRI数据采集使用3.0-Tesla MR系统（Discovery MR750， General Electric， Milwaukee， WI， USA）。用紧而舒适的泡沫垫来减少受试者的头部运动，耳塞被用来减少扫描仪的噪音干扰。3DT1加权像图像的获取采用BRAVO序列，参数设置如下：重复时 间（TR）=8.16ms；回 波 时 间（TE）=3.18ms；反 转时间（TI）=450ms；翻转角（FA）=12°；视野（FOV）=256mm×256mm；矩阵=256×256；层厚=1mm，无层间距，扫描184失状层；采集时间=357s。DTI数据采集采用SE-SS-EPI序列，参数为：TR/TE=5000/82.3ms；FOV=256mm×256mm；矩阵=128×128；平面分辨率=2mm×2mm；层厚=3mm，无层间距；扫描44轴层；25个非共线扩散梯度（b=1000s/mm2）和10个非扩散加权图像（b=0s/mm2）;获取时间=265s。所有受试者在MRI扫描时被要求闭上眼睛，放松，尽量少动，不去想任何特别的事情，但在扫描过程中不能睡着。所有MR图像均经过目视检查以确保准确无误，在随后的分析中只包括了没有可见伪影的图像。

5 DTI数据预处理

DTI预处理步骤使用分析脑扩散图像的软件包（PANDA， http://www.nitrc.org/projects/panda）[15]。具体来说，扩散加权图像首先被配准到一个参考图像上（即，第一个b0图像），通过仿射变换使涡流和头部运动造成的扭曲最小化。在剥颅骨后，我们估计了扩散张量的6个独立成分，并据此计算出分数各向异性。然后，通过确定性追踪算法，即连续追踪纤维法（FACT），以获得全脑纤维追踪成像图[16]。追踪过程从深部白质区开始，以偏转角大于50°或FA值小于0.2的体素时结束追踪。

6 结构脑网络的构建

在扩散图像的本地空间中构建结构脑网络，需要将MNI空间中的AAL模板转变到个体空间上。简单地说，首先将个体结构图像配准到它们的第一个b0图像。然后利用非线性扭曲算法对变换后的结构图像进行分割、标准化到MNI空间。倒转派生出的变形参数，将AAL模板从MNI空间转变为扩散图像本地空间上[17]。为了定义大脑结构网络的边，我们计算了任意一对节点之间的纤维数量（在纤维追踪过程中，两个节点都有端点），得到每个被试的90×90FN（fiber number，FN）矩阵（图1）。考虑到DTI分辨率和FACT算法能力的局限性，可能会包含一些伪连接。为了尽可能减少伪连接的影响，将三条纤维束的阈值应用于所有的FN矩阵，即如果至少有三条纤维束存在，则认为两个节点通过一条边相连[18-20]。最后，以FN作为每条边的权重构建结构加权脑网络[21-23]。

图1 用于构建HC（a）和WD（b）的结构加权脑网络的结构连接（纤维束条数）矩阵

7 网络分析

使用GRETNA软件对结构脑网络进行图论分析（http://www.nitrc.org/projects/gretna）[24]。计 算 结 构加权脑网络的全局网络指标。小世界属性是脑网络最常用的指标，包括集聚系数（clustering coefficient，Cp）、特征性路径长度（characteristic path length，Lp）、标准化集聚系数（normalized clustering coefficient，Gamma）、标 准 化 特 征 性 路 径 长 度（normalized characteristic path length，Lambda）和小世界（smallworldness，Sigma）[25]。Cp是对网络局部密度或集团化程度的度量，它代表网络的分割。Lp是衡量网络平均连接或总体效能的指标，它代表网络的整合。通过对100个相匹配随机脑网络的平均集聚系数和特征性路径长度进行缩放，这些随机脑网络与真实脑网络具有相同数目的节点、边和度值分布[26]，得到标准化的集聚系数Gamma和标准化的特征性路径长度Lambda。这两个度量值也可以总结为一个简单的定量指标，即小世界，Sigma = Gamma/Lambda。

已经研究发现健康人大脑网络具有最佳的小世界属性，以相对较低的成本高效传输并行信息[27]。而网络效率是一个从信息传递角度描述大脑网络的相关指标[27，28]。因此，我们计算了受试者的全局和局部水平的脑网络效率。全局效率（global efficiency，Eg）代表整个网络并行信息传输的能力。局部效率（local efficiency，Eloc）代表网络的容错能力，它反映了当一个给定节点被消除时，该节点的邻居之间的信息交流情况。

8 统计学分析

8.1 临床变量的差异 统计分析采用SPSS21.0软件包（SPSS， Chicago， Ill）进行。WD和HC组年龄的比较采用数值变量资料两独立样本Wilcoxon秩和检验；而受教育程度则是通过数值变量资料两个独立样本t检验来衡量的；组间的性别差异采用无序分类变量资料Fisher确切概率法。

8.2 网络指标的差异 为了确定2组的脑网络指标是否存在显著的组间差异，对每个脑网络指标（小世界和网络效率）进行了非参数置换检验[29]。值得注意的是，在进行置换检验之前，我们使用了多重线性回归分析来消除年龄、性别和受教育程度对每个脑网络指标的混杂影响。

8.3 网络指标和MoCA评分之间的关系 为了明确WD患者的认知情况与大脑网络的全局拓扑特性之间是否存在相关，我们将WD患者的脑结构网络指标值分别与WD患者的MoCA评分做相关分析。当WD患者的各个脑结构网络指标值分别和MoCA评分数据做相关时，若同时满足正态性时则使用Pearson相关系数分析，若不满足正态性时则采用Spearman相关系数分析。考虑到分析的探索性，双尾P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果

1 人口统计学及临床特征

WD组和HC组在年龄（Wilcoxon秩和检验，Z=-1.761，P=0.078）和 性 别（Fisher确 切 概 率 法，P=1.000）上没有显著差异。焦虑抑郁作为受试者的排除标准，HAMA和HAMD均无明显差异。同健康对照相比较，WD患者的MoCA评分明显偏低（Wilcoxon秩和检验，Z=-4.503，P＜0.001）。而WD患者的受教育程度较健康人低（双样本t检验，t=3.284，P=0.002）。见表1。

表1 人口统计学和临床特征比较

2 结构脑网络全局指标的组间差异

在3条纤维束的阈值下，通过使用GRETNA软件的双样本t检验，结果发现相对于随机脑网络，WD和HC组的结构脑网络具有更高的集聚系数（GammaHC= 4.060±0.547，GammaWD = 4.294±0.437），但几乎相同的特征路径长度（LambdaHC = 1.116±0.030，LambdaWD= 1.139±0.053），这表明2组的结构脑网络均表现出典型的小世界拓扑属性。WD组和HC组之间结构加权脑网络全局指标的差异。与HC组相比，WD患者结构脑网络的Cp、Lp明显增加，Eg、Eloc明显减少，而2组的Gamma、Lambd和Sigma之间无显著组间差异（P＞0.05）。见图2。

图2 2组之间结构加权脑网络全局指标差异

3 全局网络指标与MoCA评分之间的关系

通过对WD患者的各个脑结构网络指标值和MoCA量表评分做相关，发现Cp（Pearson相关，r = - 0.225，p = 0.339）、Sigma（Pearson相关，r = - 0.297，p = 0.203）与MoCA量表评分均无相关性；而Lp与MoCA量表评分呈现出（Spearman相关，r = - 0.673，p = 0.001）负相关，而Eg（Pearson相关，r =0.561，p = 0.010）与MoCA量表评分呈现出正相关、Eloc（Pearson相关，r = 0.530，p = 0.016）与MoCA量表评分也呈现出正相关，见图3散点图示。

图3 全局网络指标与MoCA量表评分之间的相关性

讨论

人类的大脑是由各个功能的网络组成的复杂网络的集合，包括默认网络、执行控制网络、凸显网络、背侧注意网络、腹侧注意网络、感觉运动网络、视觉网络和听觉网络等。默认网络主要负责自我相关认知，包括对情绪的处理，既往的体验等；执行控制网络多与情绪相关，并参与脑的高级认知功能等；凸显网络负责监测身体内外部的突发事件或刺激，以及默认网络和执行控制网络之间的动态切换功能等；背侧注意网络负责主动注意功能，自上而下的控制；腹侧注意网络则是通过刺激驱动的控制，属于被动的注意；感觉运动网络负责躯体的感觉和运动功能；视觉网络和听觉网络则分别负责视觉信息、听觉信息的的处理。而我们通过对WD患者全脑网络的分析研究，从大脑微观角度阐述WD患者结构脑网络的变化情况。

基于图论的复杂网络分析已被应用于量化大脑网络，这些网络具有丰富的神经生物学意义和易于计算的指标[30]。根据图论，大脑可以被描述成一个图，这个图由许多节点组成，这些节点由一组边连接起来，其中节点代表大脑区域，甚至是体素，边则代表由静息态功能磁共振测量的功能连接值或由扩散张量成像确定性追踪或概率性追踪的纤维束[31-33]。通过这些方法，研究者们发现人类大脑的结构和功能脑网络都具有最佳的小世界拓扑结构[34-35]，其特征是大脑区域间高度的局部特性和高度的全局整合，以相对较低的成本高效率传输并行信息[34，36-37]。脑网络的全局度量通常以多种方式表示，如小世界属性和网络效率，这些指标是对信息处理的整合和分离能力不同程度的量化，反映并行信息传输的能力，且对网络的容错性进行了表述[30]。

人脑在结构和功能上是一个复杂的网络，具有典型的小世界拓扑属性，即具有高集聚系数和较短的最短路径，这有利于信息处理的分离和整合[36]。最短路径刻描述的是网络中两个节点之间信息传递的最优路径，通过这种最优路径可以更快的传输信息，从而节省资源，它和全局效率一起，共同度量全脑网络长距离传输信息能力的强弱，即最短路径越短，全局效率越高，长程信息传递越快。集聚系数是衡量网络集团化程度的指标，它和局部效率一起，共同度量网络间短距离传输信息能力的强弱，即集聚系数越高，局部效率越高，局部信息传递越快。当集聚系数和最短路径都增大时，则人脑原本最佳的小世界网络，有朝正则网络转变的趋势；同样的，当集聚系数和最短路径都减小时，则有朝随机网络转变的趋势；这两种网络都不能最优的传递信息。

我们的研究发现WD患者的集聚系数和特征性路径长度都增加，表明WD患者的大脑网络有朝正则网络转变的趋势，说明WD患者的大脑网络结构已经开始被破坏，并且全局效率和局部效率的降低，也从另外一个角度反映出WD患者的大脑网络结构被破坏。我们的研究结果和之前的对子网络的研究结果相呼应。如Han[38]等使用基于后扣带回皮层（PCC）的种子功能连接分析和图论脑网络分析工具研究了默认模式网络（DMN）功能连接模式，发现同正常对照（NC）相比，WD患者改变了DMN的功能连接性并降低了局部和全局网络效率，表明网络间信息传递的能力受损。韩永升[39]等发现WD患者的众多脑区存在脑灰质和白质异常，WD患者的默认网络（DMN）和额-顶注意网络（FPAN）存在功能连接异常，这些异常可能是注意网络警觉效率受损的原因之一；WD患者存在全脑网络功能连接异常，这些网络连接异常可能是WD患者心理理论受损和共情能力下降的主要原因之一。

通过对WD患者的各个脑结构网络指标值和MoCA量表评分做相关，我们还发现Lp与MoCA量表评分呈负相关，表明特征性路径程度越长，MoCA评分就越低，说明WD患者的认知损害程度就越重；而Eg、Eloc与MoCA量表评分呈正相关，表明脑网络全局和局部传递信息的能力越低，MoCA评分就越低，也说明了WD患者的认知损害程度就越严重。或许正是由于WD患者大脑网络结构逐渐被破坏，信息传递能力下降，许多患者出现学习、记忆、计算等认知功能障碍而很早就结束了学业，进而出现受教育程度偏低的现象。我们的结果和先前的几项研究结果相一致。如Arguedas[40]等通过对WD伴神经系统症状与肝脏症状患者的神经心理学比较研究，发现WD伴神经系统症状的患者除出现视觉和语言记忆、工作记忆和注意力下降外，执行功能障碍的各个方面也很明显；并且WD伴肝脏症状的患者也出现了言语记忆困难和执行功能障碍认知损害的证据。Peyroux[41]等发现有神经系统症状和非神经系统症状的WD患者，在情绪识别、心理理论和归因方式方面的社会认识损害不尽相同。Takeuchi[42]等利用低频振幅（ALFF）和局部一致性（ReHo）方法分析研究发现在休息期间，工作记忆训练诱导了自发性大脑活动以及大脑主要网络区域中的全局和局部信息处理的可塑性，表明工作记忆训练可以改善认知功能。

在这项研究中有几个局限性。首先，威尔逊病是一种罕见的疾病，加上我们的纳入标准较为严格，使得我们的样本量偏少，为了排除受试者数量对我们结果的影响，我们将在未来招募更多的志愿者加以验证。其次，本研究中DTI的分辨率较低（25个方向），这可能会影响基于扩散张量的确定性追踪方法结果的鲁棒性，未来可尝试采集64个梯度方向的数据加以研究。最后，我们使用AAL模板将整个大脑分割成90个区域进行大脑网络构建，而有些研究指出，不同的分割方案下的节点定义可能会导致图论指标出现较大的差异[43-45]，在未来的研究中，将用不同的分割方案来检测我们的发现。