健脾益气口服液提取工艺的优化

刘巧明，崔晓娟，黄晓燕，谢 胜，杨正腾，林忆龙，奉建芳,3*，王 剑*

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；3.广西优势中成药与民族药开发工程技术研究中心，广西 南宁 530200)

健脾益气方由陈皮、黄芪、制何首乌等8味药材组成，具有健脾益气的功效[1]，临床上用于治疗小儿功能性消化不良，疗效良好，为进一步满足临床需求，课题组前期按中药1.1类新药要求将其开发成健脾益气口服液。中药复方的提取工艺在新药开发过程中至关重要，需要确定最佳的提取参数，保证有效成分尽可能提取出来，目前常用于筛选/优化中药复方提取工艺的方法有正交设计、均匀设计、因子设计、混料设计、星点设计、响应面法、人工神经网络等[2-6]。其中，响应面法已广泛应用于化工领域工艺参数、医药领域的生物活性成分提取的优化过程，通过计算自变量的相对重要性，预测自变量最优值[7]，但当变量之间存在非线性关系时，会导致其预测结果的精确度下降；人工神经网络在中药材质量控制、中药活性成分及其药物动力学、中药生产过程等方面均开展了大量研究[8]，在复杂非线性多变量的优化方面的准确性较高[9]。因此，本实验采用响应面法，分别建立响应面法、人工神经网络预测提取参数最优值，并通过中试放大试验进行验证，以期为健脾益气口服液开发提供实验基础，并评价上述2种方法的应用潜力。

1 材料

1.1 仪器 SQP电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；KQ3200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)；GZX-9420MBE电热恒温鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；LC-20A高效液相色谱仪(配置SPD-M20A紫外检测器，日本岛津公司)。

1.2 试剂与药物 党参、陈皮、黄芪、白术、制何首乌、麦冬、浮小麦、鸡内金饮片均购自南宁市宾阳县万润堂本草有限公司中药饮片厂，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为正品，符合2015年版《中国药典》标准。毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号111920-201806，纯度97.6%)、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(批号110844-201814，纯度91.0%)、橙皮苷(批号110721-201818，纯度96.2%)对照品均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯(美国Fisher公司)；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 成分含量测定 参考文献[10]报道。

2.1.1 色谱条件与系统适用性考察 Ultimate XB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.2%甲酸(B)，梯度洗脱(0～12 min，17%～37%A；12～35 min，63%A；35～40 min，63～83%A；40～55 min，83%A)；体积流量1 μg/mL；柱温30 ℃；检测波长283 nm；进样量10 μL。在该色谱条件下，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷理论塔板数均大于3 000。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，置于量瓶中，加甲醇制成每1 mL分别含三者0.012 8、0.194、0.384 μg/mL的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 称取处方量药材，按不同因素水平进行试验，回流提取，滤过，滤液备用，按因素最低水平同法制备不含黄芪、陈皮、制何首乌的阴性样品。取上述药液，13 000 r/min离心10 min，即得。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 专属性试验 精密吸取供试品、对照品溶液适量，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品溶液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色谱峰对照品溶液相应位置处无干扰，表明该方法专属性良好。

注：A～E分别为对照品、供试品、缺黄芪阴性样品、缺陈皮阴性样品、缺制何首乌阴性样品。1.毛蕊异黄酮葡萄糖苷 2.2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷 3.橙皮苷1.calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside 2.2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside 3.hesperidin图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4.2 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.50、1.25、2.50、3.75、5.00 mL至10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，在“2.1.1”项色谱条件下各进样10 μL测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程分别为毛蕊异黄酮葡萄糖苷Y=2.32×107X-1 957.07(R2=0.999 7)，线性范围0.64～6.40 μg/mL；橙皮苷Y=8.57×106X-1 736.34(R2=0.999 9)，线性范围9.70～76.80 μg/mL；2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷Y=4.53×107X-4 209.29(R2=0.999 9)，线性范围19.20～192.00 μg/mL。

2.1.4.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰面积RSD分别为0.32%、0.30%、0.58%，表明仪器精密度良好。

2.1.4.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、8、10、12、24 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量RSD分别为0.76%、0.93%、0.81%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.4.5 重复性试验 精密吸取供试品溶液6份，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量RSD分别为0.34%、0.61%、0.25%，表明该方法重复性良好。

2.1.4.6 加样回收率试验 精密吸取6份供试品溶液适量，分别加入质量浓度与体积相近的对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表1。

表1 各成分加样回收率试验结果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests for various constituents (n=6)

2.2 干膏率测定 取提取液适量，13 000 r/min离心10 min，精密量取上清液50 mL，置于干燥至恒重的蒸发皿中，在105 ℃下烘干至恒重，置于干燥器中冷却至室温，迅速精密称定质量，计算干膏率，公式为干膏率=(干膏质量/50×提取液总体积/药材投料量)×100%。

2.3 数据归一化 本实验以毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量及干膏率为评价指标，对其进行归一化处理。原始数据先转换为归一值(di)，公式为di=(yi-ymin)/(ymax-ymin)，其中ymax、ymin分别是各评价指标所能接受的最大值、最小值，再转换为总评“归一”值(OD值)，公式为OD=(d1×d2×……×di)1/i。

2.4 单因素试验

2.4.1 浸泡时间 称取1/10处方量的药材4份，加10倍量水分别浸泡1、2、3、4 h后回流提取60 min，考察浸泡时间对OD值的影响，结果见图2。由此可知，OD值随着浸泡时间延长而升高，但浸泡3、4 h差别不大，因此确定浸泡时间为3 h。

2.4.2 溶剂量 称取1/10处方量的药材4份，分别加8、10、12、16倍量水浸泡3 h后回流提取60 min，考察溶剂量对OD值的影响，结果见图2。由此可知，OD值随着料液比增加而升高，溶剂量达到12倍后趋势较为平缓。考虑到浓缩工艺等后道工序，还需对溶剂量作进一步优化。

2.4.3 提取时间 称取1/10处方量的药材4份，加12倍量水浸泡3 h后分别提取30、60、90、120 min，考察提取时间对OD值的影响，结果见图2。由此可知，提取时间为30～90 min时，OD值随着其延长而升高，而提取90、120 min时无显著差异。考虑到提取时间是影响提取效率的主要因素，还需对其作进一步优化。

2.4.4 提取次数 称取1/10处方量的药材4份，加12倍量水浸泡3 h后分别提取1、2、3、4次，每次90 min，考察提取次数对OD值的影响，结果见图2。由此可知，OD值随着提取次数增加而升高，但提取3次后上述趋势较为平缓，故选择提取次数为3次。

图2 单因素试验结果Fig.2 Results of single factor tests

2.5 响应面法 在单因素试验基础上，选择溶剂量(A)、提取时间(B)作为影响因素，OD值作为评价指标，响应面法优化提取工艺，因素水平见表2，结果见表3。

表2 因素水平 Tab.2 Factors and levels

表3 试验设计与结果Tab.3 Design and results of tests

通过Design Expert 7.1.3软件进行二次多元回归分析，得到方程为OD=-0.996 6+0.117 9A+7.971 4×10-3B+2.925 1×10-4AB-4.677 9×10-3A2-3.272 7×10-5B2，方差分析见表4。由此可知，模型拟合度较高(R2=0.990 0)，具有显著性(P<0.01)；A、B、A2对OD值有极显著影响(P<0.01)，B2、AB对OD值有显著影响(P<0.05)；失拟项不显著(P>0.05)，表明该模型可靠。

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

再通过MATLAB R2014b软件进行响应面分析，结果见图3，可知当A、B分别为16.742 2倍、132.43 min时，预测OD值为0.796 3。

图3 各因素响应面图Fig.3 Response surface plot for various factors

2.6 人工神经网络

2.6.1 模型建立 人工神经网络由2个神经元组成的输入层、4个神经元的隐藏层、1个神经元的输出层组成,设置主要参数为隐含层传递函数“Tansig”，输出层传递函数“Purelin”，训练函数“Trainlm”，最大迭代次数200次，学习速率0.1，网络计算精密度1.0×10-3，其余为默认值。表2中70%的数据用于训练神经网络模型，15%的数据用于测试，15%的数据进行验证。应用MATLAB R2014b编程运行，得到回归图(图4)和神经网络训练图(图5)，可知由于样本量少，网络得不到充分的训练，故拟合效果不佳。

图4 隐藏层回归图Fig.4 Regression diagrams for hidden layer

图5 人工神经网络训练图Fig.5 Training diagram for artificial neural network

2.6.2 遗传算法预测极值 以人工神经网络为基础，其输出(即OD值)为遗传算法的适应度函数，经种群初始化、计算适应度、遗传(反复选择/交叉/变异)后获得适应度函数最大值，设置主要参数为迭代次数100，种群规模20，交叉概率0.4，变异概率0.2，流程图见图6。经过10代左右的进化，其适应度达到最大值0.763 0，此时A、B分别为10.64倍、129.21 min，见图7。

图6 人工神经网络极值流程图Fig.6 Flow chart for artificial neural network extremum

图7 适应度曲线Fig.7 Curve for fitness

2.7 预测精度比较 本实验比较了响应面法、人工神经网络的预测精度，结果见表5，可知后者预测能力更好，误差更小。

表5 响应面法、人工神经网络预测精度比较Tab.5 Comparison of prediction accuracies for response surface method and artificial neural network

2.8 验证试验 按上述优化工艺进行3批验证试验，结果见表6。由此可知，响应面法、人工神经网络所得OD值与预测值均无显著差异(P>0.05)，但后者平均偏差更小。因此，最优提取工艺为溶剂量10.64倍，提取时间129.21 min，提取次数3次。

表6 验证试验结果Tab.6 Results of verification tests (Ⅰ, n=3)

2.9 中试提取参数筛选和验证 上述小试阶段所得的最优提取工艺在中试、大生产过程中，可能会出现加入等量溶剂及在相同提取时间、提取次数下提取效率发生变化的问题，而且中试、大生产更重视生产成本。因此，本实验通过调整溶剂量、提取时间对中试提取参数进行调整，即取10 000个制剂单位的药材，设定溶剂量为8倍，提取次数为3次(提取时间分别为60、30、30 min)，计算毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷转移率，结果见表7。由此可知，与小试阶段比较，各成分转移率无显著差异(P>0.05)，表明中试阶段提取效果未受明显影响。

表7 3种成分转移率测定结果Tab.7 Results of transfer rate determination of three constituents

再按30 000个制剂单位药材投料，即取党参等8味药材加水提取3次，第1次60 min，第2、3次各30 min，滤过，合并滤液，进行3批验证试验，结果见表8。由此可知，各成分转移率与10 000制剂单位药材投料比较，无显著差异(P>0.05)，表明该工艺稳定可靠，可用于健脾益气口服液的大规模生产。

表8 验证试验结果Tab.8 Results of verification tests (Ⅱ, n=3)

3 讨论

毛蕊异黄酮葡萄糖苷(黄芪指标成分)、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(制何首乌指标成分)、橙皮苷(陈皮指标成分)是健脾益气方中君药和臣药的重要有效物质，与药效密切相关，故将三者含量作为评价指标。中药复方在提取过程中，各因素之间、因素与水平之间存在多维度的关系，当变量为复杂非线性关系时易导致其建模能力及预测精确度下降[9,11]，故在有限的实验数据中需要一种强大的建模及预测能力工具才能将该关系客观映射。响应面法是以数学方程式的表达形式描述响应值与多个变量的关系并建立数学模型，再运用图形技术展示以供人们直观判别优化区域的数据处理方法[12-13]，该方法可将复杂问题简单化，具有较高的拟合度，常与星点设计联用以优化医药领域的生物活性提取工艺参数[14-16]。人工神经网络原理是以神经元为基本单位，模仿生物神经网络的结构与功能建立的数学计算模型，具有高容错性、能优化的特性，在拟合实验响应、预测、复杂非线性多元变量建模等方面具有更高的准确性和效率，适用于处理中药复方制剂提取工艺中多因素、多水平及非线性的问题[17-18]，研究表明，与响应面法比较，该方法在自变量未知及非线性更能体现出其建模和预测的优势[8,11]。本实验比较了响应面法、人工神经网络在健脾益气口服液提取参数寻优中的建模、预测及优化能力，发现虽然后者预测结果更接近实际值，但与前者无显著差异(P>0.05)。

综上所述，响应面法、人工神经网络均具有强大的建模能力和高准确度，适合于健脾益气口服液提取工艺小样本数据的优化，再从生产效率、可行性考虑，对所得最优参数进行中试规模的再调整。结果显示，中试规模、小试规模的提取效果无显著差异，印证了该方法的合理性和可行性。

致谢：感谢广西中医药大学中药制剂共性技术研发重点实验室梁健钦研究员为本实验提供指导。