田蓟苷固体分散体的制备及其体内药动学研究

陈晓敏，崔伟峰，李 琦

(1.郑州卫生健康职业学院，河南 郑州 450199；2.河南省中医药研究院，河南 郑州 450004；3.上海市药材有限公司，上海 200082)

田蓟苷是唇形科香青兰属植物主要活性成分[1]，为黄酮类化合物，具有抗动脉粥样硬化、抗心肌缺血、抗肿瘤、抗冠心病、降血脂等药理活性[2-3]。曾诚等[4]报道，田蓟苷为疏水性成分，导致其体外溶出速率慢，累积溶出度低，口服后体内吸收受到限制；文献[5]报道，田蓟苷口服绝对生物利用度仅为1.35%，并且不存在首关效应，故改善该成分溶解度和溶出度是提高其口服吸收生物利用度首先需要解决的问题。目前，已有采用微乳[3]、脂质体[5]等技术的相关报道，但存在制备工艺复杂、稳定性差等缺点。

固体分散体[6-9]制备方法主要有溶剂法、熔融法、喷雾干燥法等，其中喷雾干燥法操作过程简单，工业化应用程度高，该技术是通过将溶液在干燥室中迅速雾化，遇到热空气后溶剂迅速汽化，最终得到固体粉末产品[10]。本研究采用该方法制备田蓟苷固体分散体，并对其进行体外(晶型、溶解度、溶出度等)[11]和体内(药动学行为)研究，以期为相关制剂研发提供参考。

1 材料

AR2240型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；安捷伦1260型高效液相色谱仪器(美国安捷伦公司)；85-2型数显恒温磁力搅拌器(常州亿能实验仪器厂)；Tecni 12型透射电镜(荷兰Phlips公司)；TENLIN型实验室超声波细胞粉碎机(江苏天翔仪器有限公司)；D8型X射线粉末衍射仪(德国布鲁克公司)；QL-902型涡旋混合器(上海沪粤明科学仪器有限责任公司)；GIPP-2000型实验室小型喷雾干燥机(上海继普电子科技公司)；UGC-12MF型氮气吹干仪(北京优晟联合科技有限公司)。

田蓟苷(批号20190125，质量分数99.1%，上海医药工业研究院)。PVP K30(批号25000240379，美国Ashland公司)；透析袋(美国Sigma公司，截留分子量8～14 kDa)。SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号SCXK(沪)2015-0002，实验室饲养1周至体质量为(280±20)g。

2 方法与结果

2.1 固体分散体制备 采用喷雾干燥法。取田蓟苷0.35 g，加入70%乙醇1 000 mL，超声处理15 min后抽滤，继续加入1.75 g PVP K30搅拌溶解，设定喷雾干燥参数为氮气体积流量0.5 m3/min；进风温度130 ℃；出口温度60 ℃；泵体积流量5 mL/min；雾化气体积流量8.5 L/min；喷嘴孔径0.508 mm。收集固体粉末，置于30 ℃真空干燥箱中干燥2 d，密封，即得。

2.2 田蓟苷含量测定

2.2.1 色谱条件 Angilent SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.2%磷酸(55∶45,混匀后抽滤，单泵进样)；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长330 nm；进样量20 μL。理论塔板数以田蓟苷计，不低于8 000。

2.2.2 线性关系考察 取田蓟苷10 mg，置于100 mL量瓶中，加入约80 mL乙腈超声处理5 min，静置至室温后定容，作为贮备液，质量浓度为100.0 μg/mL,取适量，流动相依次稀释至10、5、1、0.2、0.1、0.02 μg/mL，即得对照品溶液，各取20 μL，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。以田蓟苷峰面积(Y)对其质量浓度(X)进行回归，得方程为Y=16.114 8X+0.612 8(r=0.999 6)，在0.02～10.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3 方法学考察 取低(0.02 μg/mL)、中(1.0 μg/mL)、高(10.0 μg/mL)质量浓度对照品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得田蓟苷峰面积RSD分别为0.16%、0.13%、0.19%，表明仪器精密度良好。取固体分散体约10 mg，置于100 mL量瓶中，加入流动相约80 mL，超声处理5 min，静置至室温后定容，0.45 μm微孔滤膜过滤，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，流动相定容，即得供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得田蓟苷峰面积RSD为0.39%，表明溶液在24 h内稳定性良好。取固体分散体适量，制备6份供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得田蓟苷含量RSD为1.36%，表明该方法重复性良好。精密称取田蓟苷含量已知的固体分散体适量，置于100 mL量瓶中，加入1.6 mg/mL对照品溶液0.5、1.0、1.5 mL及流动相约80 mL，共9份，超声处理5 min，静置至室温后定容，0.45 μm微孔滤膜过滤，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，流动相定容，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得田蓟苷平均加样回收率为100.96%，RSD为1.66%。

2.3 体外溶出度试验 预实验发现，空胶囊在溶出介质中的崩解时间约为6.5 min。取田蓟苷及其固体分散体适量(相当于田蓟苷50 mg)，装入胶囊，以900 mL0.5%SDS为释放介质，超声法脱气后注入溶出杯内，设定温度、转速分别为37 ℃、100 r/min，于10、15、20、30、60、90、120、240 min各取样3 mL(同时补充加等量介质)，0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算释放度，结果见图1。由此可知，田蓟苷最大溶出度为33.6%，而物理混合物(药载比同固体分散体)提高至45.8%；固体分散体在前120 min的溶出率大大提高，240 min内累积溶出度达95.4%。

图1 田蓟苷体外溶出曲线Fig.1 In vitro dissolution curves for tilianin

2.4 晶型分析 取田蓟苷、PVP K30、物理混合物(药载比同固体分散体)、固体分散体适量，置于样品槽中，玻璃片压平后进行扫描，设定扫描条件为铜靶，管压40 kV，管流200 mA，扫描速度5°/min，扫描范围(2θ)3°～45°，结果见图2。由此可知，田蓟苷有较多的晶型衍射峰；PVP K30为无定型载体；在物理混合物中也能观察到田蓟苷强度较高的特征晶型衍射峰，而强度相对较弱者被PVP K30掩蔽；固体分散体XRPD图谱中无田蓟苷晶型衍射峰，表明该成分在固体分散体中以无定型态存在，也证明了固体分散体是不同于物理混合物的物质。

图2 各样品XRPD图谱Fig.2 XRPD patterns for various samples

2.5 表观溶解度测定 取过量田蓟苷、物理混合物(药载比同固体分散体)、固体分散体适量，加到蒸馏水中，固定于25 ℃恒温摇床上振荡2 d，12 000 r/min离心30 min，取上清液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，结果见表1。由此可知，田蓟苷溶解度仅为2.29 μg/mL，而固体分散体提高至29.85 μg/mL；物理混合物中田蓟苷溶解度为2.92 μg/mL，可能是由于PVP K30在一定程度上改善了该成分疏水性，但影响程度有限。

表1 各样品表观溶解度测定结果(n=3)Tab.1 Resulrs of apparent solubility determination of various samples (n=3)

2.6 体内药动学研究

2.6.1 灌胃液制备 取固体分散体70 mg，加入0.5%CMC-Na溶液3 mL，即得固体分散体灌胃液；取田蓟苷12 mg，加入0.5%CMC-Na溶液3 mL，即得田蓟苷灌胃液。

2.6.2 分组及采血 采用抛币法将大鼠随机分为田蓟苷组和田蓟苷固体分散体组，每组6只，禁食过夜，自由饮水。按40 mg/kg剂量灌胃给药后，于0、0.17、0.33、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12 h眼眶取血各(0.25±0.05)mL，立即敷上棉球止血，3 000 r/min离心2 min，取血浆，冷冻保存。

2.6.3 血浆样品处理 血浆样品在室温下解冻，精密吸取200 μL至离心管中，加3 mL乙腈涡旋5 min，-4 ℃、8 000 r/min离心15 min，取上清液，45 ℃氮气吹干，加入乙腈200 μL，-4 ℃、8 000 r/min离心15 min，在“2.2.1”项色谱条件下进样20 μL测定。

2.6.4 血浆对照品溶液制备及线性关系考察 大鼠麻醉后心脏取血，-4 ℃、8 000 r/min离心15 min，作为空白血浆样品。取5 μg/mL对照品溶液，稀释至1 500、1 000、500、100、20 ng/mL，各取500 μL，氮气吹干后加入500 μL空白血浆，即得血浆对照品溶液，按“2.6.3”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样20 μL测定。取空白血浆、血浆对照品、血浆样品溶液适量，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图3，可知该方法专属性良好。以血浆样品峰面积(Y)对其质量浓度(X)进行回归，得方程为Y=0.034 8X-2.861 7(r=0.999 0)，在20～1 500 ng/mL范围内线性关系良好。

1.田蓟苷1.tilianin图3 田蓟苷HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of tilianin

2.6.5 方法学考察 取同一份血浆样品，于0、2、4、8、12、24 h冷冻、溶解后，按“2.6.3”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得田蓟苷峰面积RSD为9.83%，表明样品在24 h内稳定性良好。取20、500、1 500 ng/mL血浆对照品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得田蓟苷峰面积RSD分别为5.91%、4.53%、4.82%，表明仪器精密度良好。取同一份血浆样品，平行制备6份供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得田蓟苷峰面积RSD为9.08%，表明该方法重复性良好。取20、500、1 500 ng/mL血浆对照品溶液，按“2.6.3”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得回收率为86.53%～93.69%。取血浆对照品溶液适量，逐步稀释后在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得定量限为5 ng/mL，检测限为2 ng/mL。

2.6.6 体内药动学研究 血药浓度-时间曲线见图4，再采用DAS2.0药动学软件进行拟合，结果见表2。由此可知，固体分散体tmax短于田蓟苷(P<0.05)，可能是由于固体分散体加快了药物溶出，同时溶解度也得到提高，从而使药物顺利吸收、进入体循环的时间变短；固体分散体Cmax高于田蓟苷(P<0.01)，表明该技术可促进药物吸收；与田蓟苷比较，其固体分散体相对口服吸收生物利用度提高至2.16倍。

图4 田蓟苷血药浓度-时间曲线(n=6)Fig.4 Plasma concentration-time curves for tilianin (n=6)

表2 田蓟苷主要药动学参数Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for tilianin (n=6)

3 讨论

固体分散体制备方法一般有溶剂法、冷冻干燥法、喷雾干燥法等[12]，其中冷冻干燥法制备时部分药物可能仍以晶体状态存在，导致促溶效果不理想[13-14]；溶剂法制备时存在较高的溶剂残留问题；喷雾干燥法制备时喷出的含药雾滴可在极短时间干燥，有助于提高药物分散性，大大增加药物比表面积，从而可更大程度地提高溶解度及溶出度。本研究采用喷雾干燥法制备田蓟苷固体分散体后，其溶解度提高了13.03倍，溶出度达到95.4%，可为提高其口服吸收生物利用度奠定基础。

药动学研究结果显示，固体分散体改变了田蓟苷药动学，其tmax提前(P<0.05)，可能与固体分散体技术提高药物溶出速率有关；Cmax由(339.27±67.81)ng/mL提高至(795.35±104.81)ng/mL(P<0.01)，表明该技术可促进药物吸收，并且相对口服吸收生物利用度提高至2.16倍。虽然固体分散体能改善田蓟苷溶解度和溶出度不理想的问题，但其吸收程度还与本身脂溶性[4]、P-糖蛋白(P-gp)外排作用[3]、体内稳定性[5]等不利因素有关，从而限制了促吸收作用和生物利用度的提高程度。今后，对田蓟苷口服制剂的研究可从以下几个方面入手①采用提高药物脂溶性的制剂技术(如磷脂复合物)改善透膜吸收，并联合固体分散体技术，以期进一步提高生物利用度[15]；②加入抑制P-gp外排作用的药物或辅料；③采用固体脂质纳米粒、纳米结构脂质载体等纳米技术，从而提高药物体内稳定性、改变药物吸收途径。