微生物发酵生产饲用菌体蛋白的研究进展

■寇 慧 文晓霞 叶思廷 邹 伟

（四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 644005）

饲用菌体蛋白是指用于禽畜饲料的微生物蛋白，是指利用各种基质大规模培养细菌、酵母菌、真菌、藻类等微生物而获得的由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸以及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团[1]。饲用菌体蛋白的生产已有上百年的历史，最早利用植物纤维生产蛋白质的是德国，随后，美国、日本、加拿大、法国等国家陆续开始了菌体蛋白生产的研究。我国菌体蛋白生产始于1922 年。1986 年，我国第一个菌体蛋白饲料厂在广东省江门市建成并试产成功[2]。随着经济的增长，我国对高蛋白食物需求量的不断增长，以传统方式生产饲料蛋白的供应已不能满足市场的需求，生产蛋白的新方法成为当务之急。利用微生物生产饲用菌体蛋白具有产物营养丰富、生产速率快、占地面积小、耗费劳动力资源少、底物原料来源广泛等特点，实现其工业化生产是解决我国饲料资源紧缺的有效途径，同时使饲料资源更加优质，这为我国畜牧业的综合发展起到了很大的促进作用。近年来，我国利用微生物发酵生产饲用菌体蛋白的研究与应用发展也十分迅猛，成为我国畜牧行业研究热点。

1 饲用菌体蛋白生产的微生物

1.1 饲用菌体蛋白生产菌株选择要求

利用微生物发酵生产饲用菌体蛋白，菌种的选择是关键，是生产中非常重要的因素。生产饲用菌体蛋白的菌种除了满足一般工业微生物安全、低成本、高经济效益、来源广泛、操作简便等要求[48]以外，还应满足我国农村农业部饲料管理规范的要求，要选择《饲料添加剂品种目录（2013）》公告中规定允许使用的微生物菌种，该目录以外的菌种存在安全风险，都是禁止在生物蛋白饲料中使用的菌种。此外，一株本身无毒性的菌株可能因为理化、微生物之间的相互作用等环境因素引起负性突变，应定期对生产菌株进行致病性、感染性、毒力等方面的安全性检测或评价。

1.2 常用饲用蛋白生产菌种

目前生产饲用菌体蛋白的微生物多见于细菌、酵母、藻类、霉菌等微生物（见表1），且多趋向于不同菌株协同发酵，注重其协同性、互补性，提高饲用菌体蛋白的产量。其中常见的组合有霉菌与酵母菌、霉菌与枯草芽孢杆菌或乳酸菌等细菌。微藻与细菌合成的饲用菌体蛋白的粗蛋白含量最高，但微藻蛋白灰质含量较高，可消化性差，细菌蛋白核酸含量较高，相比而言，酵母蛋白的综合性质较优，故酵母作为饲用菌体蛋白源的研究最为广泛[49]。然而应用任何一种微生物生产饲用菌体蛋白均面临以下难题：比如研究者们所使用菌株种类不同、底物原料不同、培养条件不同，造成菌种使用量不能统一，效果也不一致；又比如在加工生产过程中，由于菌体提取工艺、核酸去除工艺、发酵条件以及原料来源的不同，蛋白饲料的营养成分均会产生差异，进而影响消化率以及畜禽的喂养效果。因此，如何在众多微生物中筛选出适用于不同原料底物的高效生产菌株、设计合理的菌种配比和混菌发酵方式、优化出适宜发酵工艺路线、微生物生产饲用菌体蛋白的营养评价、喂养效果等后处理研究还需进一步拓展和深入。

1.2.1 细菌

用于生产菌体蛋白的细菌部分利用石油、天然气等，如甲烷氧化菌，部分以光作为能源，如光合细菌，可以单独作用于生活污水、淀粉废水、脂肪酸废水等生产饲用菌体蛋白，也可同甲烷氧化菌混合协同培养产生饲用菌体蛋白。与其他微生物相比，细菌生长速率高、适应性强，且蛋白质含量高（50%～80%）[50]，如Chewapat 等[23]以城市废水作为液态培养基中的营养物质培养光合细菌，产生饲用菌体蛋白含量高达60.1%。由此可见，细菌在合成饲用菌体蛋白方面具有良好的应用前景。但细菌的应用也存在一些问题，细菌产生的蛋白质核酸含量高，尤其是RNA 高达20%[51]，需运用后处理工艺降低该蛋白质核酸的比例，导致生产成本增加。此外，细菌生产菌体蛋白还存在易受噬菌体污染、菌体小从而难从发酵液中回收等缺点。因此加快低成本的菌体蛋白核酸去除技术以及细菌蛋白分离提纯技术等方面的研究，是实现饲用细菌蛋白的大规模生产利用的一个重要突破口。

1.2.2 酵母

以碳水化合物为主要原料，经液态通风培养酵母菌，并从其发酵液中分离酵母菌体，酵母菌体经干燥后可制得饲用酵母蛋白[52]。常见的饲用菌体蛋白生产的酵母菌有产朊假丝酵母、热带假丝酵母、解脂假丝酵母、毕赤酵母、多型汉逊酵母、酿酒酵母、脂亚罗维亚酵母、海洋酵母、扣囊复膜孢酵母、白假丝酵母、皱褶假丝酵母、蓝莓酵母、核酸酵母、乙醇酵母（见表1）。酵母菌更多的是和同属的其他酵母、霉菌、细菌、真菌等混合发酵，生产饲用菌体蛋白，产量普遍不低于30%。此外，有些酵母还能利用甲醇、鸡粪等特殊底物生成饲用菌体蛋白[28,44]。目前，与其他微生物相比，酵母作为饲用菌体蛋白源的研究最为广泛，然而，酵母生长繁殖速度较慢，蛋白产量较低，后续需加强研究通过诱变育种、基因工程等技术获得菌体蛋白含量高、生长速度快、具备完整酶系的酵母，提高饲用菌体蛋白产量[18，53]。

1.2.3 霉菌

常用于生产饲用菌体蛋白的霉菌有绿色木霉、黑曲霉、里氏木霉、拟康宁木霉、康宁木霉、根霉、扣囊拟内孢霉、米曲霉、毛霉等（见表1）。其中康宁木霉与里氏木霉多用于降解果渣生产饲用菌体蛋白，并且康宁木霉多与白地霉、假丝酵母混菌发酵。赵蕾等[20]利用10种酵母和霉菌对夏橙皮渣进行发酵，以蛋白含量作为指标衡量对夏橙皮渣的降解的菌株，结果表明里氏木霉蛋白产量相对于酵母以及其他霉菌产量都高，说明里氏木霉降解夏橙皮渣的效果好，由此可以看出里氏木霉作为降解果渣的菌种生产饲用菌体蛋白具有很大的潜力。白地霉生理适应性强、细胞形体较大、易于分离回收，被广泛应用于生产饲用菌体蛋白[54]，多与酵母菌、霉菌混合发酵工业废水、废渣、粪便等底物原料，产出饲用菌体蛋白含量达15%～60%。此外，黄孢原毛平革菌、桦褐孔菌等白腐真菌属也广泛应用于饲用菌体蛋白的生产[4,10]，但相对于其他菌种，其蛋白产量并不高，因此应注重对提高蛋白产量方面的研究。目前，霉菌已广泛应用于生产菌体蛋白，但生产过程中可能会产生真菌毒素，因此应对其蛋白产物进行安全性检测。

表1 微生物在饲用菌体蛋白中的应用

1.2.4 藻类

藻类可以通过发酵将碳水化合物和非蛋白氮等有机成为转化为蛋白质，以提高饲用蛋白产量。2018年，Zahra等[34]利用绿藻和甲烷细菌混合发酵工业废水生产饲用菌体蛋白，产量高达45%。藻类合成的饲用蛋白质粗蛋白含量高、核糖核酸含量较低，且不会像真菌等微生物在繁殖末期合成具有毒性的次级代谢产物，是良好的饲用菌体蛋白源，然而藻类蛋白的生产成本高、工艺复杂高、蛋白灰质含量较高等缺陷，因此，藻类饲用蛋白的大规模开发利用仍是当前国内研究需要继续深入的点。

2 饲用菌体蛋白生产的底物原料

生产饲用菌体蛋白的底物原料极为广泛，农业废弃物、下脚料、石油化工产品及副产品、城市生活垃圾、屠宰场废弃的动物毛、粪便等均可以通过适当的预处理工艺（见图1）后作为菌体生长的营养物质。这些原料廉价便宜、在日常生活中极易获得，为大规模利用微生物发酵生产菌体蛋白提供了可能；同时这些原料多为污染源，利用微生物发酵使其变成饲用菌体蛋白，不仅能促进资源再生、环境保护，也能缓解我国饲料资源的供需矛盾。

图1 饲用菌体蛋白生产底物原料的预处理工艺

2.1 工业生产废弃物

目前，造纸、酿酒、柠檬酸、味精、淀粉及生产等工业每年排出大量废渣与废液，这些废弃物含有大量有机物、N、P、无机盐等是可供微生物生长的营养物质。淀粉、糖蜜、味精等工业废水含有大量可氧化物质（如有机物、亚硝酸盐、亚铁盐、硫化物等）以及固体悬浮物，一般没有毒性，可以添加适量辅料及试剂进行调配后接种进行液态发酵生产饲用菌体蛋白。然而，直接以工业废水为培养基接种菌种进行液态发酵时，由于发酵后将菌体分离出来干燥成产品，其余的未被利用的营养物质留在二次发酵废水中，仍有一部分工业废水污染，且液体深层发酵投资大、能耗略高、经济效益较低。因此可将废水进行适当浓缩后配备辅料进行固态发酵生产饲用菌体蛋白。对于工业产生的大量废渣可以通过高压蒸煮灭菌工艺进行预处理再接种菌种发酵生产饲用菌体蛋白，由于预处理过程中高温糊化使得淀粉颗粒中直链淀粉与支链淀粉更易被水解成为可溶性糖，供菌体利用，并且废渣经过高压灭菌后接种菌种发酵产饲用菌体蛋白，可以排除杂菌的干扰，进而提高饲用菌体蛋白的生产效率。也可直接将废渣粉碎，筛分除杂后混合适量辅料与营养物质配制成固态培养基后再接种菌种发酵生产饲用菌体蛋白。

工业废弃物直接排放不仅会对环境造成污染，并且废弃物中的有用物质流失会造成极大的浪费，然而采用化学方法处理容易引起二次污染，物理方法处理的成本较高，利用酵母、细菌等微生物将工业废弃物进行处理同时产生菌体蛋白，实现工业废弃物的资源化处理，是可行且有效的[33]。近年来，利用微藻处理工业废水，获得大量藻类菌体，并通过酸水解、超声等预处理方法破坏细胞壁，提高糖提取率，进而提高饲料蛋白质产量。此外，利用啤酒工业的废水、味精废水通过微生物发酵，获得必需氨基酸含量比常见蛋白饲料高的菌体蛋白，以充当动物饲料，国内学者也进行了广泛的研究[55-56]。光合细菌、乳酸菌、霉菌、酵母菌等微生物均可以工业废水为底物原料进行发酵生产饲用菌体蛋白，其中以酵母作为蛋白源较为广泛，且饲用蛋白产量相对较高。酿造业、淀粉、味精等工厂排放的有机废液，可以借助酵母菌细胞具有合成全效价蛋白质、能同化各种碳水化合物以及各种含氮化合物、繁殖速度快等特点，使废液通过发酵获得大量的饲用菌体蛋白。

2.2 农业副产品

我国是农业大国，农业种植面积大，农业副产物多，其营养价值丰富，可作为缓和资源短缺和降低工业成本的优质饲料来源。常见的农副产品如秸秆、麸皮、豆粕等含有丰富的纤维素、半纤维素，它们被木质素包裹形成致密的木质纤维素结构，使其不能与试剂充分接触，因此生产饲用菌体蛋白前，需要对农副产品进行物理破碎挤压，添加化学试剂、酶或微生物等预处理方法破坏复杂的木质素结构使得纤维素、半纤维素充分暴露于纤维素酶、半纤维酶环境中，生成更多可溶性糖以作碳源供菌体生长繁殖，并且通过选择合适的菌种与发酵工艺，可以得到较高的饲用菌体蛋白产量。Nayaret 等[57]利用农业废弃物和甲烷氧化细菌培养物混合生产可用于动物饲料的菌体蛋白，蛋白产量高达60.5%～66.6%。目前以秸秆、麸皮、马铃薯渣为底物原料通过微生物发酵生产饲用菌体蛋白的研究已比较广泛，且多趋向于混菌发酵。农业副产品利用难主要是由农业副产品复杂的生物质结构造成，解决的关键在于破坏其结构，降解其生物大分子。高效且低成本的降解技术是实现资源化利用农业副产品必须解决的难题，目前，物理法、化学法降解适用性和效率依旧偏低，生物降解技术操作简单且不污染环境。因此，生物降解技术是利用农业副产品生产饲用菌体蛋白研究的热门领域。目前，不少学者对生物降解菌种选育方面进行了广泛研究，但产酶力、降解率仍需进一步提高。此外，筛选高效发酵菌种，加强对调节菌体之间的协同、颉颃或竞争作用的研究，优化发酵环境、缩短发酵周期，提高饲用菌体蛋白产量、发酵规模放大也是促进农业副产品生成饲用菌体蛋白规模化利用亟需解决的难题。

2.3 石油化工产品及副产品

从20 世纪60 年代中后期开始，生产饲用菌体蛋白的底物原料在利用传统原料资源的同时，注意力转向以石油、天然气碳氢物化合物为营养源。英国、日本、意大利等国在利用石油等能源物质生产菌体蛋白方面进行了大量研究，已经有了成熟的技术和工艺[58]。70年代以来，因为用气体燃料培养微生物的工艺十分复杂，甲醇可以大量从甲烷氧化而成，并且它能与水混溶，对氧与微生物有较大的亲和力，甲醇蛋白受到了重视。英国的ICI公司以甲醇为原料生产饲用菌体蛋白，年产量7 万多吨[37]。德国的黑斯伍公司也以甲醇为原料培养细菌生产食用菌体蛋白，并建有千吨级规模的生产装置[43]。目前，国内利用石油化工产物以及副产物生产饲用菌体蛋白的实例还不多，但已有专家学者发现了用石油化工副产物生产饲用菌体蛋白具有巨大潜力，如苟万晓等[29]以甲醇为底物原料，利用实验室选育驯化出的高产甲醇蛋白的毕赤酵母作为甲醇蛋白生产菌种，获得甲醇蛋白产量（细胞干质量）为19.3 g/L；姜岷等[28]以甲醇作为唯一碳源进行筛选，获得高效利用甲醇生产甲醇蛋白的多形汉逊酵母菌，利用该菌株发酵生产甲醇蛋白，产品蛋白含量高达60%。发展甲醇蛋白能缓解饲料资源压力，然而，由于直接使用甲烷可以减少能耗转换，降低生产成本，甲烷比甲醇作为碳源培养微生物生产饲用菌体蛋白更有优势。此外，甲烷气体便于运输，且来源广泛。但真正实现甲烷饲用蛋白工业化生产还存在一些困难，如甲烷在水中溶解性差、甲烷氧化菌生长周期长等，因此还需要进一步的研究与探讨。

2.4 其他底物原料

随着城市发展和人们生活质量改善，生活垃圾、动物毛、血、粪便等也日益增加，这些垃圾不仅污染环境，也危害人们身体健康。将这些生活垃圾，如城市生活污水、餐厨垃圾、屠宰场废弃物等（见表1）经过挑出杂物、过滤、打浆等预处理过程后加入一定比例的辅料，接种酵母菌、霉菌、产甲烷菌、光合细菌等微生物进行发酵，将垃圾转化为菌体蛋白饲料，对解决我国蛋白饲料资源短缺和垃圾的资源化高效利用具有积极的促进作用。其中屠宰场废弃的动物血液营养丰富，除了含有大量蛋白质和氨基酸外，还含有钙、磷、铁、锰、锌等适量矿物质及硫胺素、核黄素、泛酸等生理活性物质，为微生物生长提供了良好的生长条件，微生物代谢效率高，有利于蛋白质积累。赵晓丹等[45]利用酵母菌、黑曲霉菌和米曲霉菌等比例混合发酵新鲜牛血，发酵过后测其粗蛋白含量高达53.81%，比发酵前增加36.50%。城市生活废水中富含氮、磷、铁、钙等适合微生物生长的营养物质，细菌、真菌、藻类等可以降解有机污染物，微生物发酵生活废水，不仅对其可达到净化的效果，同时微生物可以利用废水中的营养物质进行生长繁殖，产生大量菌体蛋白。如Chewapat 等[23]以光合细菌作为发酵菌种，接种在以城市废水作为营养源的液态培养基里，发酵生产饲用菌体蛋白，得到粗蛋白含量高达60.1%。

3 饲用菌体蛋白生产工艺

微生物发酵生产饲用菌体蛋白的方法包括固态、液态、固液态结合发酵工艺。常规发酵以固态发酵和液体深层发酵为主。根据生产用菌种不同、发酵方式不同，微生物发酵生产饲用菌体蛋白的工艺流程有所差异，但基本工艺相似（见图2）

图2 饲用菌体蛋白生产工艺

3.1 液态发酵

液态发酵的培养基里需要流动的液体基质，水是培养基的主要组分，适用于大多数微生物的生长，具有微生物从溶解水中摄取营养、营养物浓度相对均一、发酵均匀等特点，目前多应用于微生物利用工业废水生产饲用菌体蛋白（见表1）。液态发酵过程中选择合适的装液量、搅拌频率与力度、发酵温度等条件，提高饲用菌体蛋白产率，是微生物蛋白饲料生产研究过程中的一个重要内容。

3.2 固态发酵

固态发酵培养基中没有水流动，因此，能进行固态发酵的微生物一般须具备可在含水量较低的情况下快速生长、能够耐受高浓度营养盐等特性。主要包括酵母菌、霉菌、乳酸菌和芽孢杆菌等（见表1）。国内外对菌体蛋白的制取主要集中于固态发酵工艺，以豆粕、秸秆、麸皮、柑橘渣等为底物原料，利用酵母菌和霉菌进行固态发酵是目前研究较多的对象。但固态发酵具有发酵过程中的参数变化不便检测、劳动强度大等问题，因此在固态发酵生产饲用菌体蛋白过程中引入自动化设施逐渐成为必要。近年来，专家学者对机械化和自动化设备进行了很多研究，但放大试验效果不佳，不适合工业大规模应用。后续研究需要加强对固态发酵过程动力学数学模型的深入，完善系统控制技术，更加科学合理地揭示固态发酵过程的变化规律，以及固态发酵反应器，从而提高饲用菌体蛋白的产量与质量。

3.3 液固态结合发酵工艺

目前也有学者将液固态结合发酵工艺应用于微生物生产饲用菌体蛋白，如徐抗震[59]利用苹果渣为原料，采用生物技术发酵生产饲料蛋白，在获得单独固态发酵适宜生产工艺条件的基础上，提出了液固态发酵和固态发酵两种新的发酵工艺流程，通过对三种工艺形式的技术和经济可行性分析，发现液固态发酵混合菌种共生与协同作用能力强、生长快，相对接种量大，发酵时间短，设备利用率高，且蛋白含量高，适合现代工业化规模生产[48]。但国内使用液固态结合发酵生产饲用菌体蛋白饲料的工艺还不广泛，广泛使用液固态结合发酵工艺，充分吸取液态发酵与固态发酵的优点，克服两者的缺点，是研究饲用菌体蛋白生产的一个新趋势。

4 问题及展望

我国饲料工业已开启“禁抗时代”，中美贸易不确定性因素导致我国主要蛋白原料豆粕进口受影响，同时我国仍存在人畜争粮情况等因素使得我国饲料资源日趋紧张，寻找新型饲料已迫在眉睫。我国是农业大国，拥有大量农林业下脚料，并随着我国工业发展迅猛发展，产生大量工业废液，这些资源为微生物发酵生产饲用菌体蛋白提供了广泛的原料来源。生产饲用菌体蛋白的微生物来源也十分广泛，主要是非致病和非产毒的酵母菌、霉菌、细菌和藻类。虽然我国在利用农林业下脚料、工业废液、废渣等方面生产微生物饲用菌体蛋白的研究方面有成功小试，但目前尚需解决的问题还很多，如高效菌种的选育、易受有害微生物与重金属的污染、产出的饲用菌体蛋白核酸高、生产成本高、饲用菌体蛋白质量检测标准及食用效果等问题都还有待进一步研究。尽管目前微生物发酵生产饲用菌体蛋白存在一些问题，但随着人们对其研究的进一步深入，这些问题会得到很好的解决，其作为抗生素和蛋白质的替代品，具有巨大的发展潜力，将会为我国资源再生、畜牧行业的综合发展起到极大的促进作用。