上流式厌氧污泥床（UASB）启动运行性能及其不同高度微生物群落的研究

杨雅茹，李帅东，白 林，姜冬梅

（1.宜宾学院，四川 宜宾 644000；2.宜宾职业技术学院，四川 宜宾 644000；3.四川农业大学，四川 雅安 625000）

本研究利用上流式厌氧污泥床（UASB）处理来自猪场的高浓度有机废水，探究其启动运行性能和微生物在UASB 反应器不同高度的分布情况，以期为UASB的性能优化提供参考。

1 材料与方法

1.1 UASB 反应器装置 UASB 反应器由直径为0.2 m的圆柱体有机玻璃构成，上部为三相分离器和出水口，底部进水，反应器总高度为1.4 m，从三相分离器下端到反应器底部从上到下均匀分布四个取样口A、B、C、D，两个取样口之间相隔0.25 m，有效体积36 L。

1.2 启动运行控制 本试验水质为猪场废水，取自四川农业大学养猪场，化学需氧量（COD）达到8 000～10 000 mg∕L，pH 值为6.8～7.8；接种污泥为四川农业大学污水处理厂ABR 反应器排出的厌氧污泥，污泥量占反应器总体积的21%。

UASB 启动方案：在常温下（20～30 ℃）采用连续进水的方式，初始进水流量设置为18 L∕d，流量设置及对应的水力停留时间（HRT）如表1 所示。在第一个水力停留时间，进水浓度不断升高，直至升到6 000 mg∕L。出水浓度和去除率达到稳定后，提高进水流量为28.8 L∕d，进入HRT2阶段，出水浓度COD再次稳定后，继续减少HRT，使之达到设计水流量72 L∕d。每日定时监测出水pH值，保证其在7.2～7.8之间。

表1 不同进水流量对应的水力停留时间（HRT）

1.3 不同高度污水、污泥样品的采集 在每个HRT 对反应器从上到下O、A、B、C、D、I 六个取样口的污水（含污泥）取样，样品置于高温灭菌的聚乙烯瓶中，冰上保存并及时运送至实验室。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 废水水质指标 检测方法主要依据中华人民共和国国家标准测定法及《水和废水监测分析方法》。本研究主要检测的水质指标及方法见表2。

表2 水质监测指标及方法

1.4.2 16S rDNA 测序 利用提取污泥和废水的DNA 试剂盒对样品进行DNA 提取，将废水、污泥样品总DNA通过Illumina Miseq技术测序平台对16S rDNA V4区的PCR产物进行高通量测序。

1.5 微生物测序结果分析 使用QIIME1.8.0 软件过滤测序数据。通过Flash软件将有Overlap的一对Reads 进行拼接，并对其数目进行统计。根据97%相似性使用Uclust 软件对序列聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units），代表是一组来源于某一个相同分类单元的序列。从同一OTUs 中取一条代表性序列，使用RDP Classifier进行下游的物种注释分析。

2 结果与讨论

2.1 UASB 启动及运行 反应器共运行了96 d，整个试验过程COD去除情况见图1。在水力停留时间为48 h（HRT1）阶段，随着进水COD 浓度升高，出水口的COD 浓度缓缓降低，最低COD 浓度为336 mg∕L，COD 去除率最高能达到89.58%，此时的容积负荷从0.16 kgCOD∕m3·d 升高到1.4 kgCOD∕m3·d，这样以高频小幅的方式提升，可缩短调试期。

在水力停留时间为30 h、24 h和12 h（HRT 2、HRT3和HRT4）阶段，进水浓度维持在6 000 mg∕L左右时，每个HRT 的出水COD 呈现先升高后降低的趋势，最终趋于稳定。经过4 个HRT 的运行，COD去除率最终能达到80%以上。

沼气产率如图1 所示。在整个启动阶段，沼气产率一共有四个波峰，分别对应四个运行阶段。在第一个阶段，随着反应器运行，沼气产率不断升高，最高升到了0.886 4 L∕L·d，但是当HRT降低为30 h时，最高产率只有0.418 4 L∕L·d；后两个HRT 阶段的沼气最高产率又恢复到0.9 L∕L·d左右，分别为0.890 1 L∕L·d、0.899 8 L∕L·d。说明在第二阶段的时候，反应器正在适应高浓度的COD，因此可以推测当反应器从固定HRT、升高浓度进水变为保持固定高浓度进水、降低HRT这个转变过程会影响沼气产率。

图1 UASB反应器启动期间进水COD、出水COD和产气率

启动中后期，容积负荷变化范围为2.62～10.95 kgCOD∕m3·d。本次试验中，用UASB处理常温下的猪场废水，最高容积负荷和产气率都较高，表明反应器不同的设计参数和运行情况会影响产气率。

2.2 UASB 启动阶段反应器不同高度微生物群落的变化分析

2.2.1 微生物群落丰富度和多样性分析 根据97%相似性聚类成的OTU数目和Alpha多样性分析结果来看（见图2），发现在UASB启动期间的每个HRT 阶段，微生物群落的丰富度指数（Chao1）和多样性指数（Shannon）会沿着反应器高度呈现不同的差异性［1］。HRT1阶段，微生物群落丰富度表现为中下部＞顶部＞中上部＞底部（C1＞A1＞B1＞D1）；微生物多样性则表现为中上部＞顶部＞中下部＞底部（B1＞A1＞C1＞D1）。当缩短水力停留时间为30 h（HRT2阶段）时，微生物群落丰富度沿着UASB 反应器高度增加而下降；微生物多样性表现为底部最高，中下部最低。HRT3 阶段，微生物群落丰富度变化趋势为顶部＞中下部＞中上部＞底部（A3＞C3＞B3＞D3）；微生物多样性沿着反应器高度增加而升高。HRT4 阶段，微生物群落的丰富度指数表现为中下部＞中上部＞顶部＞底部（C4＞B4＞A4＞D4）；多样性指数和HRT3阶段的变化趋势一致。

图2 OTU、Chao1和Shannon统计图

2.2.2 物种注释分析 采用RDP Classfier 对每一条OUTs的一条代表性序列进行下游物种注释分析，共得到60 个门、133 个纲、233 个目、253 个科、590 个属水平的细菌和一些无法归类的细菌。利用UASB 反应器处理猪场废水时，不同启动阶段优势菌群在门水平上是相似的，分别为属于古菌的广古菌门（Euryarchaeota）和属于细菌的拟杆菌（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Fimicutes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、阴沟单胞菌门（WWE1），属水平上为甲烷丝菌属（Methanosaeta）、拟杆菌目（Bacteroidales）和互养菌属（Syntrophus），但占细菌总数的百分比不同。在细菌16S rRNA测序中发现了古菌，这是由于细菌和古菌在此基因序列上有较高的同源性［2］。

本试验中广古菌门（Euryarchaeota）启动初期就是优势菌，与徐锐［3］的研究不一致，可能是因为接种污泥自身就带有Euryarchaeota。Euryarchaeota的甲烷丝菌属（Methanosaeta）在属水平上也是反应器的优势菌，Methanosaeta是专性乙酸营养型产甲烷古菌，可利用多种代谢底物产生甲烷（如乙酸、氢气∕二氧化碳），适于生活在高负荷和中性pH 条件下［4］。在启动时期不同HRT 下，Methanosaeta的丰度沿着反应器的高度被量化，在前三个HRT 下，其最高值都位于反应器中下部，只有在启动末期沿反应器高度自下而上呈现降低趋势。乙酸型产甲烷古菌的生长与颗粒生物膜密切相关，启动末期底部最高，说明大部分颗粒污泥都集中在底层，若颗粒退化，其生物丰度也会降低［5］。

启动初期和末期，拟杆菌（Bacteroidetes）都集中在中上部和顶部，启动中期会有一段时间集中在反应器底部（如HRT2）。Bacteroidetes的拟杆菌目（Bacteroidales）在目水平上是优势菌，在UASB反应器不同高度的丰度变化趋势和Bacteroidetes一致，只有在启动中后期依然保持底部较高水平，表明Bacteroidales在降解反应器有机底物（如蛋白质和多糖）中起到了非常关键的作用，可为甲烷的产生提供更多的底物［6］。

有研究表明变形菌门（Proteobacteria）在去除有机物中起了非常重要的作用［7-8］，主要参与消耗乙酸、丙酸和丁酸等有机酸，若Proteobacteria量少，有机酸产生量可能也会少。在启动初期，Proteobacteria主要在反应器顶部聚集，在中后期直至末期，反应器不同高度的Proteobacteria都没有较明显的差异，表明厌氧反应器在启动初期产生有机酸的位置可能是在反应器顶部。在启动中后期，Proteobacteria的量远远低于启动的其他时期，我们猜想有可能在启动中后期会有一段产酸的抑制时期。Proteobacteria在属水平上的互养菌属（Syntrophus）是启动期反应器的优势菌，对产甲烷能力的提升有重要作用。有研究表明，Syntrophus是具有直接种间电子传递能力的细菌之一，可以提升厌氧反应器中有机物转化成甲烷的速率［9］。在反应器启动初期和末期，Syntrophus集中在底部，沿反应器高度增加量逐渐减少，表明启动初期和末期主要是底部的Syntrophus在进行种间电子传递，从而提高产甲烷的速率。启动中期，不仅反应器不同高度Syntrophus的量没有明显差异，而且Syntrophus的总量也低于启动前期和后期，表明启动中期Syntrophus产甲烷速率可能有所降低，这也与本试验中启动中期（HRT2）产气能力下降一致。但启动中后期产甲烷能力是非常高的，表明在启动中后期对产甲烷能力起主要作用的菌不是Syntrophus，而是其他细菌或（和）古菌。

厚壁菌门（Fimicutes）是一种细胞壁较厚的细菌，其肽聚糖可以通过产生内孢子抵抗极端环境，因此对高有机负荷环境具有高耐受性［10］。猪场废水恰好属于高有机负荷的废水，因此，Fimicutes属于反应器中的第三优势菌。Fimicutes在反应器不同高度的量会随着启动阶段的不同表现出一定的差异。在启动初期和末期，反应器不同高度的Fimicutes量没有明显差异，但启动中后期在反应器顶部，Fimicutes的量增加。有研究证明Fimicutes的变化趋势与甲烷产量呈现正相关，因其极有可能会降解蛋白质、多糖或腐殖酸［6］。本试验启动中后期（HRT3），Fimicutes的量高于前面几个阶段，和产甲烷量最多一致，表明此阶段Fimicutes最重要的一个功能有可能就是产甲烷。但是微生物群体之间存在协同作用，若其中一些群体的功能失效，另外一些群体将补偿该特定功能（代偿性）［11］。因此，不排除Fimicutes有可能此时在补偿某些产甲烷菌群的功能。

绿弯菌门（Chloroflexi）具有产生水解酶的功能，主要降解的是可溶性微生物产物，如可溶性蛋白和可溶性多糖等。在UASB 反应器中，Chloroflexi基本都集中在反应器底部，只有在启动中期会有一段时间在反应器中上部，表明反应器中可溶性的微生物产物大部分位于反应器底部，颗粒污泥也是大部分位于反应器底部。阴沟单胞菌门（WWE1）是Chouari 在2005 年从城市污水处理厂发现并命名为候补门，后被重新命名为“Cloacimonetes”，其广泛存在于猪的消化道以及厌氧反应器中［12］。本研究中WWE1 在启动初期和末期，反应器底部的量高于中部和顶部，但这两段启动时期的总量都小于启动中期。而启动中期反应器不同高度的丰度有差异，启动的中前期，WWE1 主要聚集在反应器中下部，顶部较少，启动中后期，反应器不同高度的WWE1 量没有明显变化，但总量高于其余启动时期。因此，推测WWE1可能是启动中后期提升产甲烷能力的主要细菌。

3 结论

3.1 采用设计的UASB 处理猪场废水，容积负荷从0.16 kgCOD∕m3·d 升高到1.4 kgCOD∕m3·d，设计的反应器可处理6 000 mg∕L COD浓度的粪水，产气率最高能达到0.9 L∕L·d左右，COD去除率最高为89.58%。

3.2 UASB 反应器在启动时期的不同高度，优势菌种类没有变化，在门水平上为属于古菌的广古菌门和属于细菌的拟杆菌、变形菌门、厚壁菌门、绿弯菌门、阴沟单胞菌门，属水平上为甲烷丝菌属、拟杆菌目和互养菌属。但优势菌会有量的差异：广古菌门、绿弯菌门和阴沟单胞菌门主要位于反应器底部和中下部；拟杆菌、变形菌门、厚壁菌门主要位于反应器中部和上部；甲烷丝菌属和互养菌属主要位于反应器底部和中下部，拟杆菌目主要位于反应器中部和上部。