真菌毒素分子印迹聚合物的制备及与其快检技术联用的研究进展

张 乐,李 壮,赵民娟,李 辉,邵 华,佘永新,金 芬,王 静

(中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081)

我国是一个农业大国，人们以植物源性食物为主，谷物、瓜果、蔬菜是营养膳食中必不可少的结构单元，这些可为人类提供每天所必须的营养，但同时其质量是否安全放心也成为我们现在所担心的问题。真菌毒素是真菌生物产生的次生代谢产物。霉菌主要是由曲霉菌、青霉菌、镰刀菌、链格胞菌以及克劳维普斯等产生[1]。毒素的产生主要取决于产地、气候以及储藏条件[2]。因此，真菌毒素在很多食物以及加工产品中都可以见到，并且它们在加工和处理过程中很稳定。但大多数的真菌毒素还是来自于种植过程中[3]。对人类和动物造成的危害，主要是通过食用的过程。即使霉菌毒素只存在于痕量水平的浓度，它们在食品中的积累是一个全球性的问题，不仅影响人类和动物健康，也会引发经济后果[4]。

真菌毒素污染谷物较多，例如玉米是许多国家的主食，镰刀菌是主要的产毒菌，在成熟颗粒上生长可能会导致真菌毒素的污染。在波兰，从玉米种类中分离出的真菌只有2%～10%属于镰刀菌属；但在非洲尤其是南非，玉米谷物中的伏马菌素的含量很高。玉米中的伏马菌素与食管癌有着很高的相关度[5]。由于它们的毒性作用，摄入也就意味着对人类健康有一定的风险。有数据统计，全世界每年约有25%的食物受到不同程度的真菌毒素污染,每年由于霉变污染导致真菌毒素引起的农产品和工业原料的损失达数百亿美元[6]。

我国展青霉素在水果、饮料、酒类中的限量标准是50 μg/kg，对脱氧雪腐镰刀菌烯醇在谷物中的限量指标是1 000 μg/kg，黄曲霉毒素B1在玉米及其制品中的限量是20 μg/kg，在糙米等中的限量是10 μg/kg，在小麦、大麦及其他谷物中的限量却是5 μg/kg，黄曲霉毒素M1在乳及乳制品中的限量指标是0.5 μg/kg，赭曲霉毒素A在谷物中的限量指标是5.0 μg/kg，玉米赤霉烯酮在谷物中的限量指标是60 μg/kg。相比FAO，我国在食品中规定的限量指标较高，同样也说明真菌毒素在我国的食品中污染较为严重。常见的真菌毒素检测方法有快速筛检法和仪器确证法,快速筛检法有基于抗原抗体识别的酶联免疫吸附法[7]、表面等离子共振技术[8]、纳米技术[9]及荧光检测技术[10-11]等；仪器确证法主要以色谱法为主，有液气色谱法、液气相-质谱联用法及薄层色谱法等。谢瑜杰[12]建立了HPLC-MS/MS同时测定牛奶中6种玉米赤霉烯酮类化合物的检测方法，具有灵敏度高,重现性好的特点。黄思瑜等[13]建立了UPLC-MS/MS同时测定香辛料中7种真菌毒素的方法，该方法的优点是前处理简单、净化效果好、灵敏度高和高通量检测。万亚美等[14]建立超高效液相色谱-串联质谱检测青贮玉米中9种真菌毒素的方法，具有快速灵敏,准确可靠的特点。孙娟[15]等建立了测定谷物中12种常见真菌毒素的超高效液相色谱串联质谱分析方法，该方法具有前处理简单、净化效果好、灵敏度高和检测速度快的优点。这些方法虽然应用比较广泛，但是依然存在一些问题，如色谱法仪器昂贵，操作复杂，时间长且分离物极性相差较小时，分离效果不好。免疫检测技术对分析物的检测灵敏度很高，但是检测成本昂贵，检测过程要求高，使用的真菌毒素全抗原和抗体均为生物材料，受外界环境影响大，所以这就限制了该方法的应用[16]。所以需要一种快速的前处理方法处理真菌毒素。

分子印迹技术(MIT)也称为分子模板技术，是以目的分子或者结构类似物为模板与功能单体在交联剂的作用下通过共价或非共价合成高度交联的三维网状结构聚合物的技术，通过此方法合成的聚合物称为分子印迹聚合物。用有机溶剂萃取去除模板分子，在聚合物的网络中留下在形状、大小和功能上与模板分子互补的特定识别位点。但是，可能很难完全去除模板分子，从而导致假阳性结果，所以可以使用模拟物也就是假模板来代替聚合反应期间分析物本身[17-18]来制备聚合物。分子印迹聚合物也经常看作是亚分子生物化学中天然抗体、受体、酶的替代物[19]。

我们重点介绍近年来研究的新型毒素，链格孢霉毒素-桔霉素的分子印迹聚合物的制备技术，以及纳米技术与分子印迹技术等杂化技术在真菌毒素检测中的最新应用现状，并分析分子印迹技术在检测真菌毒素中的应用前景以及有待解决的问题。

1 主要真菌毒素MIP聚合物的制备及其应用

1.1 展青霉毒素

展青霉毒素是公认的食品污染物，它们可能会给人类和动物带来潜在的健康危害[20]。它是由青霉菌、曲霉菌等产生，主要污染水果如苹果、苹果汁以及其相关产品，谷物、芝士以及蔬菜[21]。FAO对展青霉素建立的PMTDI为0.4 μg/kg。由于展青霉毒素用作模板分子的价格昂贵并且毒性较大，故在制备展青霉毒素分子印迹聚合物时大都选用其结构类似物作为替代模板分子来降低实验的安全风险。赵民娟等[22]采用沉淀聚合法，使用2-吲哚酮和6-羟基烟碱作为模板分子，合成了用于展青霉素检测的MIP聚合物,将所研制的MIP聚合物作为一种选择性吸附剂,应用于固相萃取法测定低浓度的展青霉素。该方法相比于QuEChERS方法，可以更有效的去除样品中的杂质，减少基质效应，表现出较好的回收率、特异性、精密度和重现性。MI-SPE方法在食品中具有广阔的应用前景。Nafiseh等[23]用展青霉毒素作为模板分子，高过氧化活性的AgNPs@ZnMOF复合材料作为分子印迹聚合物的有效载体，制备MIP，用于展青霉毒素的选择性测定。由于展青霉毒素的电子捕获特性，它显著的降低了AgNPs@ZnMOF复合材料的催化活性,MIP的选择性识别特性与AgNPs@ZnMOF复合材料的类过氧化物活性及灵敏的荧光检测系统相结合，设计出展青霉毒素探针，此方法具有能在不受模拟化合物干扰的情况下，在复杂介质中选择性的测量感光度的优点。赵民娟等[24]首次利用双模板分子即2-吲哚酮和6-羟基烟酸为虚拟模板分子合成了展青霉毒素分子印迹聚合物，采用沉淀聚合法制备展青霉毒素分子印迹聚合物。将此聚合物做为填料制备的 MI-SPE 柱对果汁样品中展青霉素进行分离富集，有大大降低 HPLC-MS/MS 检测中的基质干扰的优点。

1.2 链格孢霉毒素

链格孢霉毒素是谷物中的相关污染物，但也见于油籽、番茄、苹果、柑橘类水果、橄榄和其他几种水果和蔬菜中。链格孢菌会导致这些商品在冷藏运输和储存过程中甚至在低温下变质。西红柿对真菌侵染的敏感性很高，特别是链格孢属物种。Rico-Yuste等[25]以3,8,9-三羟基-6h-二苯并[b，d]吡喃6酮(S2)为链格孢霉毒素、链格孢菌(AOH)和链格孢单甲醚(AEM)的替代模板剂，4-乙烯基吡啶(4-VP)和甲基丙烯酰胺(MAM)为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂，制备了有选择性的链格孢霉毒素分子印迹多孔聚合物微球。

1.3 赭曲霉毒素

赭曲霉毒素A(OTA)是由部分曲霉菌和青霉菌产生的有毒代谢物，存在于各类饲料原料中，对动物和人类的健康会产生危害，产生肾毒性、肝毒性、致畸、致癌等[26],Pichon等[27]以改变了赭曲霉毒素的氨基酸亚结构的产物为模板，聚甲基丙烯酸甲酯为功能单体，乙烯二甲基丙烯酸甲酯为交联剂合成了赭曲霉毒素-MIP聚合物。López-puertollano等[28]以OTA的羧基化衍生物为模板分子，丙烯酸为功能单体，采用固相合成法将OTA固定在玻璃微珠上制备MIP纳米材料。

1.4 黄曲霉毒素

黄曲霉毒素主要是黄曲霉、寄生曲霉产生的次级代谢产物。黄曲霉毒素有很多种，其中黄曲霉毒素B1最为常见且毒性也最强[29]。Arak等[30]以5，7-二甲氧基香豆素为模板，采用本体聚合法合成了分子印迹聚合物MIP，制备了不同摩尔比的模板剂与功能单体和交联剂，得到了最佳的工作摩尔比为1∶4∶20。此实验得出的结论是本体聚合制备MIP后所得颗粒的性质均较不规则，导致了高表面积，这是此方法的不足之处；但优点在于使用MIP和CTB可以防止黄曲霉毒素对肝组织的毒性作用，并且MIP可能有效的与其他霉菌毒素结合。Sergeyeva等[19]以黄曲霉毒素B1为模板分子，合成了选择性MIP膜。所制备的聚合物可作为荧光传感器中的高灵敏度识别元件，使用计算模拟方法可选择能够与黄曲霉毒素B1形成强络合物的功能单体。结果表明，烯丙胺、丙烯酰胺、乙基甲基丙烯酸酯、N,N-二甲基丙烯酰胺和2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸与FAB1相互作用，显示出高结合能。该方法还可以对黄曲霉毒素分子和不同功能单体之间形成的配合物的结构进行可视化，这能够预测MIP膜中纳米结合位点的潜在结构；并且MIP膜可有效地用于水溶液中黄曲霉毒素B1的提取和传感器原型中黄曲霉毒素B1的定量，提供高选择性检测，检测限为14 ng/ml。其优点是所开发的传感器系统易于使用，价格低廉，并提供了高度敏感和选择性的黄曲霉毒素实时检测。Chmangui等[31]研究了以5,7-二甲氧基香豆素(DMC)为模板分子，甲基丙烯酸(MAA)为功能单体进行MIP合成。MIP-QDs(量子点)复合物可作为非乳饮料总黄曲霉毒素的筛选方法，所制备的荧光探针对黄曲霉毒素(B1、B2、G1和G2)具有选择性。此荧光法的优点是简单且廉价，可用于食品中总黄曲霉毒素的筛选。Jiang等[32]以黄曲霉毒素B1为模板分子，电聚合对氨基苯硫酚功能化纳米金，研制出一种敏感的电化学印迹传感器，用于检测黄曲霉毒素B1。以铁氰化物/铁氰化物溶液为氧化还原探针，采用线性扫描伏安法研究了所研制的黄曲霉毒素B1检测传感器的性能。此实验是一种基于MIP聚合物/AuNPS杂化膜的黄曲霉毒素B1敏感电化学传感器的研究，其优点在于此MIP杂化传感器具有良好的灵敏度和重复性，有望成为食品中黄曲霉毒素B1选择性电化学检测的有效方法。Guo等[33]以5,7-二甲氧基香豆素为模板分子，以3-氨基丙基三乙氧基硅烷为功能单体，制备了包覆CdTe量子点的分子印迹聚合物(MIP@CdTe QDs)、模板分子、功能单体，交联剂的最佳摩尔比为4∶20∶15，采用傅里叶变换红外光谱、透射电镜、荧光光谱对复合材料进行表征。该方法可快速检测复杂基体中其他微量外源性有害物质。Rui等[34]以黄曲霉毒素结构类似物为模板分子，介孔二氧化硅FDU-12作载体制备了高选择性分子印迹聚合物FDU-12@MIPs，通过扫描电镜、能量散射X射线，傅里叶变换红外光谱对聚合物进行表征。该方法的优点是可以用于实际样品中黄曲霉毒素的富集。Song等[35]以6-甲基-4-苯基色满-2-酮为虚拟模板，甲基丙烯酸、甲基丙烯酸脱水甘油酯为功能单体，采用悬浮聚合法制备了一种生物相容性好的分子印迹聚合物，用扫描电镜和粒度分布对所得聚合物进行表征。此方法的不足在于回收率较低，但优点是可以对谷物样品中的黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A进行替代选择。

1.5 伏马菌素B1

伏马菌素B1(FB1)是一种主要由黄萎病菌和增生病菌产生的有毒次生代谢物，污染玉米、大米等粮食，也会危害人体健康[36]。Munawar等[37]以伏马菌素为模板，利用计算机技术设计纳米材料，分析不同丙烯酸单体与FB1分子之间的互相作用，选择出结合率最高的丙烯酸单体乙二醇甲基丙烯酸酯磷酸酯、N,N-二乙基-甲基丙烯酸氨基乙酯，通过亲和层析实验测定单体与模板的结合，验证了单体对FB1的亲和力。采用固相合成法制备纳米球，得到的样品具有高选择性，不显示与其他毒素的交叉反应，回收率高。

1.6 桔霉素

桔霉素是一种具有高毒性且致癌、致畸、致突变的真菌毒素，主要产生于青霉、曲霉、红曲霉的代谢过程，污染谷物等植物食品。在体内大量蓄积，会导致肾脏器官病变，致畸、致癌。Lee等[38]以1-萘酚为虚拟模板，二乙烯基苯为交联剂，采用两步沉淀法制备了桔霉素分子印迹聚合物粒子，测定的水稻回收率较低，但此复合膜可作为水稻提取物中桔霉素的一种有价值的使用材料。刘桂洋[39]以1-羟基-2-萘甲酸为假模板分子，修饰有介孔碳-金纳米颗粒功能复合物的石英晶体金电极表面电聚合邻氨基苯硫酚形成分子印迹聚合物膜,从而特异性检测桔霉素。该方法对桔霉素有很好的压电响应，检出限低，显示出良好的选择识别能力、抗干扰能力、重现性以及长期稳定性,并成功应用于谷物样品中痕量桔霉素的加标回收实验,这种压电传感器为食品中痕量桔霉素的检测提供了一种新的方法。Atar等[40]采用印迹伏安传感器测定黑麦样品中的桔霉素，此方法的优点是检测限低，且对桔霉素具有较高灵敏度。李鸿英[41]采用本体聚合方法以3,5-二羟基-2-萘甲酸为假模板分子,甲基丙烯酸为功能单体,在酶标板孔表面直接紫外引发合成了对桔霉素分子印迹聚合物膜,成功将分子印迹技术应用于免疫分析中,建立了一种食品中桔霉素分子印迹仿生酶联免疫吸附法。所合成的分子印迹聚合物膜对桔霉素具有良好的特异性吸附能力和较快的吸附速度。王倩[42]以桔霉素的结构类似物1,4-萘二甲酸为模板分子，3-氨基丙基三乙氧基硅烷作为功能单体，采用将表面分子印迹技术与溶胶-凝胶技术二者相结合的途径,合成了能够较好的识别待测物桔霉素的分子印迹材料。该聚合物对桔霉素具有较高的饱和吸附容量,并且传质速度快,具有很好的实用性。齐云宵[43]用水热法合成六方相上转换荧光纳米材料，合成了对桔霉素有较高选择性的分子印迹材料，在最优条件下合成的荧光分子印迹聚合物,随桔霉素浓度的增大，聚合物的猝灭程度增大，通过做3种样品的添加回收实验，验证了此检测方法的可行性。

2 真菌毒素分子印迹快速检测技术研究进展

随着人们生活质量的提高，对真菌毒素越来越关注，目前对真菌毒素的检测技术也是有很多，邹淼等[44]利用超高相液相色谱-串联质谱法对粮油中16种真菌毒素进行了检测，刘胜利[45]用液相色谱技术对黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、单端孢霉烯族毒素、伏马菌素、赭曲霉毒素、杂色曲霉毒素进行了检测，邹笑航[46]利用改进的酶联免疫技术(ELISA)对黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮进行了检测。检测技术各有千秋，但是这些检测技术的缺点非常明显，前处理很复杂，实验仪器昂贵，实验成本较高，这就使得这个方法不能对大量样品进行快速筛查。酶联免疫法可以对样品进行快速筛查，阳性样本可以进行仪器确证，成本低，可广泛利用；但是专一性不强，准确度低[47]，所以需要高效、快速、经济、适合大批量检测的技术。

2.1 酶联免疫技术

免疫亲和是利用抗原和抗体之间的高度特异性的亲和力来实现目标物的分离和纯化，有特异型强，选择性好，富集效率高等特点，王韦岗[48]等建立了一种复合免疫亲和柱-在线光化学衍生-高效液相色谱同时测定谷物及其制品中9种真菌毒素的检测方法。该方法具有重现性好、灵敏度高、结果准确的特点,适用于谷物及其制品中9种真菌毒素残留的分析检测。邹沫君[49]等建立了同时测定玉米制品中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的免疫亲和柱净化高效液相色谱方法。该方法具有操作简便、灵敏度高、重现性佳等优点,适用于同时检测玉米制品中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮。免疫层析技术是一种结合了免疫技术和色谱层析技术的检测分析方法，以胶体金作为标记物的层析技术，作为快速检测试纸条广泛用于各个领域。沙志聪[50]等构建了一种基于量子点标记的免疫层析试纸条用于检测谷物中赭曲霉毒素A的残留量，通过活化酯法将羧基功能化的量子点(QD)与赭曲霉毒素A多克隆抗体(Ab)偶联制备量子点抗体偶联物(QD-Ab)，该方法操作简便、检测快速、结果准确灵敏,易于判断,可以满足谷物中赭曲霉毒素A残留量现场快速检测的要求。适配体是一种良好的抗体代替品，是单链DNA或RNA，可以特异性的结合到目标分子上，与抗体相比有显著的优势，且生产成本低。Shim等[51]报道了一种基于适配体的快速、简便、现场检测黄曲霉毒素B1的方法，他们使用一种针对AFB1的生物素修饰的适配体和一种能与该适配体杂交的单一DNA探针 (Cy5)作为荧光材料，分别以链霉亲和素和抗Cy5抗体，作为实验区和控制区，并将其用于被AFB1污染的玉米样品中，该方法的优点是操作简单，可现场测定，是一种简便的快检技术。Ma等[52]制备一种对AFB1具有该亲和特异性的ssDNA序列，通过特异性实验得到亲和性高的AFB1适配体序列，利用AFB1适配体建立了检测AFB1的荧光生物传感器，对纯品和花生油样检测，结果良好。

2.2 纳米传感器技术

张文刚[53]利用MIPs修饰Mn-ZnS来构建磷光纳米传感器(MIP-Mn:ZnS)以检测苹果汁中的PAT，本方法的分析结果与(HPLC)的检测结果基本一致,表明方法具有良好的准确性和可行性。并且此研究构建了一种简单、快速、可行的苹果汁中展青霉素非免疫磷光检测方法,可为复杂食品基质中展青霉素的快速检测提供一定的理论及技术依据。Wang等[54]制备了一种基于Ru(bpy)32+(RuSi NPs)的二氧化硅纳米颗粒的电化学传感器，检测赭曲霉毒素A的MIP分子，所制备的传感器对目标分子具有很高的灵敏度和选择性，较低的检测限，并且成功的应用在玉米中检测赭曲霉毒素A。Yola[55]研究了一种基于纳米银颗粒的分子印迹伏安传感器，该伏安传感器应用到葡萄汁和葡萄酒中，具有良好的选择性和回收率。王庆玲[56]将电化学发光传感器与分子印迹技术相结合测定玉米中的赭曲霉毒素A，既提高了电致发光的选择性，又提高了分子印迹技术的灵敏度。Magro等[57]合成了一种表面活性磁赤铁矿纳米粒子(SAMNs)，利用SAMNs表面三价铁原子的有效性，在生物机制中识别和磁性去除红曲中的桔霉素。该纳米粒子在水中很稳定，没有任何表面修饰和涂层衍生化，具有选择性结合多个生物分子的能力。Shao[58]等将Au@Au-Ag NNSs纳米颗粒与Fe3O4MNPs偶联，用于对赭曲霉毒素A进行检测，可以明显的引起拉曼强度的变化。与纯金属纳米颗粒相比，Au@Au-Ag NNSs纳米颗粒可有效增强拉曼信号分子的拉曼强度，超微小的纳米间隙，有助于传感系统的灵敏度，是一种绿色、简便、经济的方法。此研究中赭曲霉毒素A的检测限低至0.004 ng/ml。此方法的优点是快速、灵敏、低成本。

2.3 荧光技术

量子点(QDs)是一种半导体纳米晶体，是一种新型的半导体荧光材料，具有高量子产率和窄发射光谱，利用QDs 优异的光学特性，将 QDs 和 MIPs 相结合制成 QDs@ MIPs可用于分子的光敏化研究,在量子点表面进行分子印迹制备的聚合物具有易成型和高选择性的特点[59]。闫祯[60]开发了一种兼具选择性和荧光信号的分子印迹聚合物,能高选择、高灵敏地识别痕量赭曲霉毒素A。光纤传感器是一种将被测物的信号转变成可被测量到的光信号的传感仪器，它具有体积小、重量轻、灵活性和鲁棒性，与建立在芯片上的传感器相比，将传感器集成在光纤上并使用易于测量的光学元件，可以在困难的环境中进行远程测试[61]。以赭曲霉毒素A的结构类似物HNA-Phe为模板，3-氨基丙基三乙氧基硅烷为功能单体,合成了对赭曲霉毒素A具有高选择性的荧光分子印迹聚合物(UCNPs@SiO2@MIPs)，此实验的结果与HPLC结果有较好的一致性，所建立的方法准确可行，并且此方法的优点在于不使用大型仪器，操作简单。樊超[62]基于分子印迹技术和量子点荧光特性,研究开发了一种基于离子液体稳定CdSe/ZnS量子点的荧光分子印迹聚合物,能高选择、高灵敏地识别真菌毒素玉米赤霉烯酮。马慧颖[63]等将量子点表面分子印迹技术和光纤传感技术相结合制备出荧光猝灭型量子点表面分子印迹传感器，用于快速高效的检测大分子、小分子物质。该方法的优点在于既具备分子印迹技术优越的预定性、识别性，又兼具光纤传感器的高稳定性、高灵敏性和抗干扰能力。在食品安全中有很大的应用前景。

2.4 拉曼光谱技术

拉曼光谱可以定性和定量的测定真菌毒素的化学官能团及其衍生物，有操作简单，损耗少，快速，重复性好，灵敏度高等特点。但常规的拉曼技术存在信号弱的问题，所以可以将被检测物质吸附在金、铜、银或者一些不常用的碱金属上，来增加信号强度[64]。张晶晶等[65]以青霉素为MIP模板，采用恒电位技术在玻碳电极表面一步电沉积制备石墨烯-纳米金-壳聚糖的分子印迹电化学传感器(PG-MIP-rGO/AuNPs/CS)，对表面增强拉曼光谱(SERS)性能进行了表征。该传感器对青霉素的SERS响应灵敏，最低检测限为1.1×10-8mol/L (S/N=3)。同时，制备的分子印迹SERS传感器可以被成功用于实际环境水样中青霉素残留的测定。

3 问题与展望

作为多功能材料，MIPs的模板灵活性及物理稳定性和热稳定性比其他检测技术突出，因此，MIPs在样品预处理、色谱分离、化学和生物传感器等领域引起了广泛的关注。迄今为止，基于MIPs的各种小分子、蛋白质和离子的研究已经迅速开展。虽然在真菌毒素的检测方面应用逐渐增加，仍有较多问题有待解决：①新的印迹材料较少，有待开发新材料。②在真菌毒素的检测中使用较多的是虚拟模板，这与真正的模板分子存在一定的差别，得到的聚合物可能存在得不到预期的使用效果。③分子印迹合成的聚合物有一定的不可控性，重现性不好。④分子印迹聚合物中的功能单体与交联剂的选择范围较少，开展新的功能单体提高MIPs的选择识别性，提供更高的识别位点，更高的吸附容量。⑤加强分子印迹技术与传感器等新技术的联用，与新技术联用后可以弥补单独使用的缺漏，提高检测结果。分子印迹技术是目前发展较快的技术之一，随着现在科学技术的发展，相信分子印迹技术在真菌毒素的检测方面将发挥更大的作用。