细胞自噬及其在肝纤维化中的作用

代倩兰，刘绍能

中国中医科学院广安门医院 消化内科，北京 100053

自噬是机体维持内环境稳态的重要机制，也是近年来国内外研究的热点。越来越多的研究证明自噬与肝纤维化关系密切，在活化肝星状细胞(HSC)、保护肝细胞、稳定肝窦内皮细胞(LSEC)等过程中发挥着重要的作用。肝纤维化是慢性肝损伤的一种修复反应，是由于肌成纤维细胞(myo-fibroblasts,MF)产生的细胞外基质(ECM)不断积累引起的[1-2]。MF是各种慢性肝损伤过程中产生ECM的主要细胞，而HSC是MF的主要来源[3], 所以HSC的活化是肝纤维化发生、发展的核心环节。此外，免疫细胞、细胞因子、信号通路等也是影响肝纤维化的重要因素。在这个过程中，自噬也起着重要的作用，本文对自噬的过程、功能及其在肝纤维化中的作用作一综述。

1 自噬的发生过程

自噬是指真核细胞内溶酶体参与长寿蛋白质、受损细胞器以及入侵微生物的降解来维持细胞内稳态的过程[4-5]。在1962年，Ashford和Porter就提出细胞中存在“self-eating(自食)”现象[6]，比利时细胞学家Christiande Duve和Robert Wattiaeux引入“autophagy(自噬)”的概念用以区分细胞内和细胞外物质的降解[7]，至20世纪80年代日本科学家Yoshinori Ohsumi通过研究酵母细胞自噬得出自噬的部分机制。近年来，自噬的机制及自噬在各种疾病中的作用研究取得了一定的进展，但仍不明晰。

自噬发生的整个过程由自噬相关基因(autophagy-related genes，Atg)及其编码的Atg蛋白分子家族所介导，包括 LC3、Beclin1、PI3K等30多个基因[8]。自噬的过程可分为4个步骤：(1)自噬的诱发。细胞在缺乏营养、能量供应以及氮或氨基酸合成受限时，主要通过雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)与ULK1复合物之间产生相互作用，进而通过自噬基因组装形成前自噬体。(2)自噬体形成。隔膜延伸并包裹部分细胞质与细胞器形成双层膜结构的自噬体，具体过程主要包括两条泛素化途径Atg5-Atg12-Atg16和 LC3-II的修饰过程。(3)自噬体运输、融合。自噬体经诱导到达溶酶体，自噬体外膜融合溶酶体膜，而内膜和自噬体的内部物质则进入溶酶体内，构成了可以在电镜下观察到的自噬溶酶体。(4)自噬体和内部物质的降解、重利用。在自噬溶酶体内，自噬体膜和内容物被降解，产生的大分子物质通过通透酶Atg22被回收到细胞质中以供利用[9]。

哺乳动物的细胞自噬，根据底物被运输到溶酶体内的方式不同可分为三类。(1)巨自噬：由内质网来源的膜包绕待降解物形成自噬体，然后与溶酶体融合并降解其内容物，目前的研究大多聚集在巨自噬，通常所说的自噬即巨自噬；(2)微自噬：溶酶体膜直接包裹受损细胞器、蛋白质等，并将其降解；(3)分子伴侣介导的自噬：胞质内的蛋白被分子伴侣识别并结合后共同转运到溶酶体腔中，然后被溶酶体酶消化并降解[10-12]。根据自噬对降解底物的选择性将自噬分为非选择性自噬和选择性自噬：前者指细胞质内的细胞器或其他胞质成分随机运输到溶酶体降解；后者指自噬对降解底物具有专一性。而选择性自噬根据对底物选择性的不同又分为：线粒体自噬、过氧化物酶体自噬、脂噬、内质网自噬等[4,13]。

2 自噬的生物学功能

从细胞水平讲，自噬是维持细胞内环境稳定的一条必不可少的代谢途径，是一种自我保护机制。细胞在正常生长条件下能进行较低水平的基础自噬，但是当受到一些刺激时会迅速上调[14]。自噬能够消耗自身成分产生脂肪酸、氨基酸、核苷酸等，为处于饥饿状态的细胞提供维持自身功能的能量；能够处理过剩或损伤的细胞器、错误折叠的蛋白质和蛋白聚集物，维持机体内环境稳定；也能够清除入侵的微生物，保护细胞。但自噬过度活跃或者功能低下，能引起自噬应激，损伤细胞器，甚至促进细胞的死亡。从生物水平讲，自噬对生物体的生长和发育起重要作用，自噬可以通过特异的降解某些蛋白或细胞因子来改变细胞的组成，决定细胞分化、发育的方向等[14]。此外，自噬参与多种疾病的致病过程，自噬或调节自噬的环节异常都可导致疾病发生。大量研究[15-16]证明自噬与神经系统疾病、肿瘤、肺部疾病等密切相关，可以利用诱导或抑制自噬来对抗疾病。

自噬在维持肝脏动态平衡和调节肝脏功能中起着重要作用。肝脏富含溶酶体，并具有高水平的代谢应激诱导的自噬[17]。肝脏是葡萄糖、脂质代谢，解毒以及激素、胆汁酸合成的重要器官，葡萄糖和脂质与选择性自噬密切相关，病毒感染与复制也受自噬的影响。众多研究发现自噬在脂肪性肝病、病毒性肝炎、肝硬化等慢性肝病的发生发展中起重要作用，而肝纤维化作为慢性肝病的修复反应更是受自噬的调节和影响。

3 自噬与肝纤维化

3.1 自噬促进HSC活化 HSC也叫贮脂细胞，其胞内含有大量的脂滴，是生成MF的主要细胞群。正常情况下处于静息状态的HSC位于肝脏窦周Disse腔内，当肝脏受损伤时，各种因素的刺激导致静息状态下的HSC激活成为具有增殖性、收缩性、成纤维性的MF[18]，形态变得大而扁平，脂质减少，转而向组织受损部位迁移并积累，分泌多种促炎因子、促纤维化因子，并通过旁分泌和自分泌作用，进一步刺激未激活转化的HSC转变为MF。其最突出的特征是胞质脂滴的消失和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达增加[19-20]。HSC的活化与其自噬密切相关，尤其是脂噬[21-22]。

研究[23]发现，在四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型中，自噬相关基因LC3B在肝组织中表达明显增加，在原代培养的、活化的HSC中得到相同的结果，从乙型肝炎纤维化肝组织中分离出的HSC亦发现自噬活性明显增强[24]，表明肝纤维化时HSC的自噬活性增强。也有另一个角度的研究[22]发现自噬相关基因Atg2A缺失的HSC在细胞培养中不能进行自发的向MF转化，自噬相关基因Atg5或Atg7在HSC特异性缺失的小鼠不容易被四氯化碳诱导致肝纤维化[25]，可以看出HSC的活化依赖于自噬。这主要是由于自噬介导的脂质降解[26]，即脂噬，自噬通过脂滴的动员、游离脂肪酸的释放和线粒体β氧化为HSC的活化提供能量,从而将HSC从静止态转变为激活态[27]。研究[21,28]发现在体外活化培养小鼠的HSC过程中，自噬通量明显增加,脂噬将脂滴分解为自由视黄酯释放到细胞外间隙，在脂肪酶的酶解作用下形成自由脂肪酸，从而促进线粒体内ATP的产生和HSC活化；抑制其自噬则ATP的产生减少，从而抑制HSC活化。用四氯化碳诱导特异性自噬相关基因Atg5或Atg7缺失的小鼠产生肝纤维化，结果肝纤维化程度好转,同时HSC中脂滴的丢失减少[24]。综上所述，HSC自噬尤其是脂噬为HSC活化供能，抑制HSC的自噬可以减轻肝纤维化的发生与发展。

3.2 自噬保护肝细胞的作用 肝脏细胞分为肝实质细胞(肝细胞)和非实质细胞，肝细胞约占肝内细胞总数的60%，当持续性肝损伤时通过旁分泌作用激活HSC活化，促进纤维化进程。在肝细胞中，自噬主要作为一种细胞保护机制，保持细胞内稳态、抑制肝细胞凋亡，从而抑制肝纤维化[29]。肝细胞受到损伤时可发生选择性自噬，降低细胞发生氧化应激和脂质过氧化损伤的可能性[28]，保护受损的肝细胞。在慢性乙型肝炎中，肝细胞自噬的激活能够抑制HBV复制，同时也抑制HBV感染的肝细胞凋亡[30]；在脂肪性肝病中，肝细胞脂质的积累可以诱导HSC活化而致肝纤维化[31]，而脂噬活性提高可以减少脂肪堆积；在酒精性肝病、肝毒性药物、缺血/再灌注损伤所致的肝细胞损伤中，脂滴、错误折叠的蛋白及细胞内受损的内质网、线粒体等细胞器能通过自噬的有效调节进行分解代谢及清除，为肝细胞提供能量和物质的需求[32-35]，均起到抑制肝细胞损伤的作用。此外，在遗传性疾病α1抗胰蛋白酶(α1-AT)缺陷而致肝纤维化的小鼠中，用自噬诱导剂雷帕霉素诱导肝细胞发生自噬，可发现肝纤维化的程度明显减轻[36-37]。自噬主要通过保护受损细胞、抑制细胞凋亡而抑制肝纤维化。

3.3 自噬对LSEC的作用 LSEC是非实质细胞的一种，其结构特点是无隔膜的窗孔及缺如完整的基底膜，主要介导肝脏的过滤与清除功能，以此维持肝内稳态。当出现慢性肝损伤时，受损的LSEC出现失去窗孔、形成有组织的连续基底膜和肝窦毛细血管化等改变，并通过合成TGFβ和血小板衍生生长因子导致HSC的增殖与活化，ECM积累，促进肝纤维化的发生发展[38-39]。自噬可维持LSEC的稳态。在体外和体内的LSEC毛细血管化过程中自噬均会迅速上调，使用药物或者基因下调LSEC自噬会增加氧化应激反应。在体内肝损伤期间，LSEC自噬的选择性丧失导致细胞功能障碍，肝内NO降低，氧化应激损伤，加重纤维化[40]。自噬有助于维持内皮细胞稳态，并保护LSEC在疾病的早期阶段免受氧化应激。在肝脏疾病的早期阶段选择性地在LSEC中增强自噬可能是改变疾病病程和防止纤维化进展的一种可行的方法[41]。此外，也有研究[42]发现抑制LSEC自噬可以减轻肝纤维化，caveolin-1(Cav-1)是LSEC中与自噬相关的一种结构蛋白，Cav-1的自噬降低可以通过抑制NO依赖性途径和F-肌动蛋白重塑而促进LSEC的防御,从而减轻肝纤维化。这可能与动物模型不同以及肝纤维化的时期不同有关。

3.4 自噬与抗炎作用 肝脏巨噬细胞包括肝脏固有巨噬细胞即Kupffer细胞和肝损伤时自外周募集而来的单核细胞衍生巨噬细胞(monocyte-derived macrophages，MoMF)[43]。巨噬细胞具有高度的可塑性和异质性，会朝向不同的表型极化，分为M1型和M2型巨噬细胞，其表面标志物以及所产生的细胞因子均存在多样性。肝脏巨噬细胞合成和分泌TGFβ1等纤维化细胞因子，可以激活HSC和MF,导致肝纤维化[44]。肝脏巨噬细胞被广泛认为在炎症中具有促纤维化作用，其中的机制可能与MoMF的聚集有关，抑制肝脏募集外周巨噬细胞，能减轻肝纤维化[45]。M1型巨噬细胞释放促炎细胞因子或趋化因子，能够放大炎症反应并有助于成纤维细胞的增殖和招募；当病变持续存在M2型巨噬细胞发挥重要的促分裂作用，并分泌TGFβ1、PDGF、VEGF、IL-1A、IL-1B 等激活成纤维细胞，加重肝纤维化。

巨噬细胞自噬主要通过抑制炎症小体的激活，从而抑制分泌促炎和纤维化细胞因子的分泌，起到对肝纤维化的抑制作用[46-47]。研究[48]发现Atg5缺乏的小鼠更容易受四氯化碳诱导致肝纤维化，并且在体外研究中，Atg5缺乏的小鼠肝脏IL-1A和IL-1B水平较高，炎症细胞募集增强，导致纤维化加重。Tao等[49]研究发现自噬的抑制降低了细胞质CTSB，减轻了NLRP3炎性小体的活化，从而减弱了NaAsO诱导的HSC活化，提示NaAsO通过自噬-CTSB-NLRP3炎性体途径诱导HSC活化。也有研究[50]发现，缺乏自噬的肝巨噬细胞可通过增强线粒体活性氧-NF-κB-IL-1α/β途径促进肝纤维化的发生。

此外，自噬还能通过调控T淋巴细胞的活化抑制炎症反应，主要通过调节巨噬细胞和树突细胞的炎症反应来实现。自噬缺陷的巨噬细胞能过度分泌IL-1α和 IL-1β，这两种胞因子与IL-6和TGFβ一起促进Th0细胞向Th17细胞分化并分泌IL-17[51]，对树突状细胞自噬的抑制也增强了T淋巴细胞炎症介质的产生，包括IL-17分泌升高所诱发的系列免疫反应[52]。

3.5 自噬参与信号传导 近年来，自噬与信号通路的研究日益增多。甲基腺嘌呤(3-MA)是一种选择性的Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂，能阻断自噬体的形成，Cassidy等[53]研究发现3-MA可抑制HSC自噬标志物和转录调节因子NF-κB在体内的表达，减轻四氯化碳诱导的肝纤维化。氧化应激可以促进肝纤维化的发生发展[54]，而Nrf2-keap1-ARE是主要的抗氧化应激轴，王莹等[55]研究发现LC3Ⅱ可介导自噬底物p62蛋白消耗，继而抑制Nrf2抗氧化应激通路，促进肝纤维化进展。此外TGFβ1/Smads通路、mTOR/STAT3通路等都参与自噬的调节从而影响肝纤维化[56-59]。最近研究[60]发现，HSC自噬可以通过减少细胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)的释放而减轻肝纤维化。在肝脏中，受损肝细胞和LSEC产生的EV可诱导HSC的活化和迁移，进而参与肝纤维化的进程。

4 结语

细胞自噬在肝纤维化过程中的作用是复杂的，并且具有双向性。从目前的研究来看，自噬上调加重肝纤维化的作用主要是在HSC自噬中促进HSC活化，尤其是脂噬可以为其活化提供能量。而自噬上调对肝纤维化的抑制作用则主要体现在肝细胞以及LSEC自噬的保护作用和免疫细胞自噬增强抗炎作用中。此外，多种信号通路研究提示，HSC自噬上调加重肝纤维化，而在最近的研究中发现，HSC自噬上调可减少EV释放，从而抑制肝纤维化。不同种类细胞的自噬以及不同底物不同水平的细胞自噬可能对肝纤维化的作用机制有所偏重或不同。此外，其复杂性也许与疾病的种类和纤维化的时期有关。在以后的研究中，应该限定更多条件，更加细化的研究自噬在不同细胞、不同阶段肝纤维化中的机制和作用，找到更确定和可靠的机制和靶点，进而为选择性的干预肝细胞自噬、治疗肝纤维化提供新途径。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：代倩兰负责查找文献，资料分析，撰写论文；刘绍能负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。