核苷(酸)类似物经治的慢性乙型肝炎患者低病毒血症的研究现状

鲁凤民，封 波，郑素军，蒋素贞，杨瑞锋，福军亮，纪 冬，党双锁，鲁晓擘，陈红松，陈新月，任 红，高志良，南月敏，徐小元，牛俊奇，张文宏，庄 辉

1 北京大学 基础医学院 病原生物学系暨感染病中心，北京 100191; 2 北京大学人民医院, 北京大学肝病研究所，北京 100044; 3 首都医科大学附属北京佑安医院 肝病中心一科，北京 100069; 4 解放军总医院第五医学中心 肝纤维诊疗中心，北京 100039; 5 西安交通大学第二附属医院 感染科，西安 710004； 6 新疆医科大学第一附属医院 感染科·肝病中心 乌鲁木齐 830054； 7 重庆医科大学 病毒性肝炎研究所，重庆 400060； 8 中山大学附属第三医院 感染性疾病科，广州 510630; 9 河北医科大学第三医院 中西医结合肝病科，石家庄 050051; 10 北京大学第一医院 感染疾病中心，北京 100034； 11 吉林大学第一医院 肝胆胰内科，长春 130021; 12 复旦大学附属华山医院 感染科，上海 200040

HBV感染是慢性乙型肝炎(CHB)、肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌(HCC)的重要病因。全球约有2.57亿慢性HBV感染者，每年死于HBV感染相关肝硬化、肝衰竭和HCC的患者高达88.7万人[1]。我国现存慢性HBV感染者仍超过7000万人，其中CHB患者高达2000～3000万例，严重危害国人健康[2]。

目前临床抗HBV治疗药物有核苷(酸)类似物(NAs)和聚乙二醇干扰素α(PEG-IFNα)。由于这两类药物均不能直接清除肝细胞核内的共价闭合环状DNA(cccDNA)，HBV感染难以彻底“治愈”。因此，国内外主要指南均以最大限度地长期抑制HBV复制，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，降低肝硬化和肝癌风险，从而改善生活质量和延长生存时间作为CHB抗病毒治疗的目标[2]。由于NAs抑制HBV DNA复制作用强、副作用小和给药方便等原因，临床应用更为广泛，其中恩替卡韦(ETV)、富马酸替诺福韦酯(TDF)和富马酸丙酚替诺福韦(TAF)具有强效抑制病毒和低耐药等优势，被推荐为一线NAs。

近年来，在长期接受规范的NAs治疗患者中，即使应用ETV、TDF或TAF一线药物，部分患者的血清HBV DNA仍持续或间歇性地低水平检出阳性，即存在低病毒血症(low-level viremia，LLV)问题。由于LLV可能促进肝纤维化进展、显著增加肝硬化患者HCC风险，针对LLV的研究已成为目前抗病毒治疗的热点和难点问题。本文将就LLV的定义、流行病学、对临床结局的影响、发生机制及管理策略等方面的研究现状和进展综述如下。

1 LLV的定义

亚太肝病学会(APASL)2015年版乙型肝炎指南[3]中将“部分病毒学应答(partial virological response，PVR)”定义为：依从性良好患者接受NAs至少6个月或12个月的治疗后，HBV DNA下降超过1 log10IU/ml但仍可检测到；欧洲肝病学会(EASL)2017年版乙型肝炎指南[4]定义PVR为：依从性良好的患者在接受至少12个月的NAs治疗后，HBV DNA下降超过1 log10IU/ml，但HBV DNA仍为阳性。我国2019年版乙型肝炎防治指南[2]在“应答不佳患者”部分中提到，CHB患者采用一线NAs治疗48周，排除依从性和检测误差后，HBV DNA>2000 IU/ml。

目前，国内外对LLV尚无公认的定义。2018年美国肝病学会(AASLD)指南[5]指出：持续LLV是指HBV DNA<2000 IU/ml但仍能检测到(最低检测限为10 IU/ml)的患者。有学者[6]将LLV患者定义为HBV DNA<2000 IU/ml，但仍能检测到，包括持续性或间歇性LLV。笔者建议，慢性HBV感染者接受ETV、TDF或TAF等一线药物治疗至少48周以上，血清HBV DNA采用灵敏qPCR法(最低检测限为20 IU/ml或10 IU/ml)仍可检测到，但<2000 IU/ml，在排除依从性问题及病毒耐药突变后，定义为LLV。LLV可以分为两类：持续性LLV是指用灵敏的qPCR法检测至少2次，每次间隔3～6个月，血清HBV DNA均为阳性，但均<2000 IU/ml；间歇性LLV是指用灵敏的qPCR法检测至少3次，每次间隔3～6个月，HBV DNA呈间歇性阳性，但<2000 IU/ml。

诊断LLV时应排除：(1)患者对抗病毒治疗的依从性差，如漏服抗病毒药，自己减少药物剂量，或自己改为隔天服药，或服药方法不当 (如ETV未遵从餐前或餐后至少2 h空腹服用) 等。(2)基线HBV DNA水平对48周NAs治疗效果的影响。HBV DNA≥108拷贝/ml的患者治疗至52周时HBV DNA虽有明显下降，但仍可检测到的概率为33.8%，持续治疗3年时为23.5%[7]。对这些高病毒载量患者或许应该延长治疗后再观察时间再作LLV的诊断。(3)HBV耐药突变：包括ETV治疗后耐药，拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、阿德福韦酯(ADV)经治的ETV耐药[8]；TDF耐药也偶有报道，如B基因型及D基因型中rtA181V和rtN236T双突变位点的TDF耐药等[9]。由于临床指南对耐药引起的HBV DNA低水平复制有明确的处置意见，故本文中定义LLV时将耐药排除在外。(4)药物与药物、药物与食物的相互作用对一线NAs抗病毒作用的可能影响[10]。(5)排除HBV检测因污染带来的“假阳性”结果的可能。

2 NAs治疗下的LLV发生率

考虑到低耐药屏障NAs(如LAM、ADV、LdT)已经不作为CHB治疗的首选药物，本文仅限于对目前一线NAs药物ETV、TDF或TAF相关的LLV展开讨论。

2012年的EASL指南[11]曾总结了ETV和TDF治疗后患者的HBV DNA阴转情况：ETV治疗48周或52周，HBeAg阳性和阴性患者血清HBV DNA可检出率分别为33%与10%(HBV DNA<60～80 IU/ml)；TDF治疗48周或52周，HBeAg阳性及阴性患者的血清HBV DNA可检出率分别为24%及7%(HBV DNA<60～80 IU/ml)。TAF治疗临床研究[12-13]结果表明，治疗48周的HBeAg阳性和阴性患者的HBV DNA可检出率(HBV DNA>29 IU/ml)分别为36%及7%。TDF治疗96周的HBeAg阳性和阴性患者的HBV DNA可检出率分别为25%及9%；TAF治疗96周的HBeAg阳性和阴性患者的HBV DNA可检出率分别为27%及10%(HBV DNA>29 IU/ml)[14]。

随着HBV DNA定量检测技术的不断革新，病毒载量的检测下限越来越低。因此，旧检测方法定义的病毒学应答，在使用更灵敏的检测方法时可能被归为LLV的范畴。一项研究[15]中，141份普通HBV DNA检测试剂结果阴性的标本用高敏方法检测，存在以下5种情况，即>500、20～500、10～20、<10 IU/ml和阴性，比例分别为13.5%、31.9%、18.4%、30.5%和5.7%。Lee等[16]对894例接受ETV治疗的CHB患者回顾性观察分析中发现，平均5年的随访期间，654例(73.2%)达到维持病毒学应答[MVR，即达到完全病毒学应答后，在随访期间HBV DNA持续检测不到(HBV DNA<12 IU/ml)]，即达到完全病毒学应答后，在随访期间HBV DNA持续检测不到 (HBV DNA <12 IU/ml)；240例(26.8%)出现LLV(HBV DNA>12 IU/ml)。另一项875例接受ETV治疗的CHB患者回顾性队列研究中，在平均4.5年的治疗随访期间498例(56.9%) 达到MVR，377例(43.1%)出现LLV(HBV DNA>12 IU/ml)[6]。上述结果提示，先前研究NAs类药物治疗下获得的病毒抑制率可能偏高，而LLV的发生率可能被低估。

3 LLV对CHB患者预后的影响：不利于肝纤维化逆转，肝硬化患者HCC发病风险显著增加

一项对239例有基线及治疗78周时2次肝活检、接受抗病毒治疗的肝纤维化患者的随访研究[17]表明，治疗78周后肝纤维化进展的患者其HBV DNA检出率为50%，明显高于发生肝纤维化逆转患者(19%)和肝纤维化是否逆转难以确定的患者(26%) (P=0.015)，表明LLV可能不利于CHB患者肝纤维化逆转，甚至可促进肝纤维化进展。

近年来的一些研究表明，NAs治疗下血清HBV DNA和 pgRNA低值阳性可能与疾病进展和肝癌的发生有关。一项来自我国香港的队列研究[18]采用了更加灵敏的HBV DNA和HBV RNA(检测下限分别为10 IU/ml和51.5 IU/ml)检测方法，结果显示，NAs治疗下HBV DNA和pgRNA 低值阳性与患者HCC发生有关。在ETV治疗乙型肝炎相关肝硬化失代偿期患者中，未达到病毒学应答(HBV DNA<20 IU/ml)已被证实是HCC发生的重要危险因素(HR=7.74，P=0.022)[19]。而在接受ETV治疗的肝硬化患者，PVR是治疗2年后发生HCC的独立危险因素[20]。Kim等[6]研究也表明，LLV患者比MVR患者更易发生HCC(14.3% vs 7.5%,P=0.015),其危险比为1.98(P=0.002)，其中肝硬化伴LLV患者的HCC风险明显高于MVR者(23.4% vs 10.3%，P=0.002)。然而，对于非肝硬化患者，该研究未发现LLV和MVR患者之间的HCC风险存在显著差异。这些研究提示，对于肝硬化患者，LLV与更高的肝癌风险相关。但也有研究[16]显示，不考虑ETV服药依从性情况下，LLV是肝癌发生的独立危险因素(P=0.031)；而在高依从性组中，MVR组和LLV组的肝脏相关死亡或移植、肝癌和肝脏失代偿的发生率无显著差异。这表明在真实世界中坚持ETV治疗的患者，NAs治疗期间的LLV可能不是HCC和肝硬化并发症的危险因素。目前，有关LLV的危害尚缺乏更多前瞻性研究数据，但无论如何，NAs治疗下LLV患者的预后值得密切关注。

4 LLV发生的可能机制

4.1 NAs竞争性抑制作用的局限性 HBV cccDNA以微小染色体的形式稳定地存在于感染肝细胞核内，是HBV感染慢性化和难以治愈的关键[21-22]。cccDNA的来源包括初始感染和胞内复制回补2种途径[23]。新感染病毒进入肝细胞后，病毒核衣壳将HBV松弛环状DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)带入肝细胞核内并在宿主DNA修复系统的作用下转化为cccDNA。由其转录的pgRNA既是核心抗原和P蛋白的mRNA，又可作为逆转录模板形成新的rcDNA。新合成的rcDNA一方面可成为有感染性的完整病毒颗粒，再感染新的正常肝细胞；另一方面，新合成的rcDNA也可进入细胞核，经过修复后回补核内cccDNA，以维持肝细胞核内cccDNA池的稳定性[24]。NAs药物的作用机制正是通过与细胞内dNTP竞争性地与P蛋白结合，抑制子代病毒rcDNA的合成。不同的NAs在具体作用机制上存在差异。其中临床上曾广泛使用的模拟dATP的ADV和模拟dCTP的LAM在磷酸化后不具有3′端的-OH，无法继续形成磷酸二酯键，进而终止DNA负链的合成[25-26]；β-L-核苷类似物LdT在体外抑制DNA聚合酶活性并抑制DNA正链的合成[27]。目前各大指南推荐的模拟dGTP的ETV在磷酸化后具有正常的3′-OH，掺入合成中的DNA链后仍有DNA链的合成，但由于空间位阻，在插入位点后2～3 nt处终止[28-29]；新型的无环5′-单磷酸腺苷类似物TDF在磷酸化后缺少3′-OH并在体外剂量依赖性抑制P蛋白活性[30]。

前文提到，这些NAs是通过与细胞内源dNTP竞争结合抑制P蛋白的活性来抑制HBV DNA复制。在同一种细胞中各种脱氧核苷酸含量存在一定差异，平均胞内每种dNTP含量约为10 nmol/108个细胞水平[31]。NAs药物需与胞内不同浓度的dNTP竞争才能有效抑制P蛋白活性。以半最大效应浓度(EC50)为3.75 nmol/L、有效半衰期为24 h的ETV为例[32]，在HepG2.2.15细胞培养液中加入100 μmol/L的ETV，6 h后使用TOF-LC/MS系统检测胞内ETV浓度为5 pmol/2×106个细胞，胞内三磷酸化(TP)ETV浓度为5 pmol/6×105个细胞[33]。即向细胞培养液中加入高浓度的ETV药物后，胞内ETV-TP浓度约为dNTP浓度的1/12。由此可见，NAs掺入逆转录形成的脱氧苷核酸链中，虽然可以不可逆地抑制该病毒新DNA链的合成，然而由于胞内大量dNTP的存在，NAs并不能彻底地抑制HBV复制[34]，NAs不能阻止新感染肝细胞中cccDNA的形成[35]，这为控制CHB患者HBV对新肝细胞的感染、有效耗竭cccDNA池带来了新的挑战。因此需要长期NAs治疗以尽可能耗竭cccDNA，降低停药后复发的风险。值得庆幸的是，一旦有NAs的掺入，子代病毒将因其DNA链的不可逆终止而失去感染性[36]。

综上，NAs对HBV逆转录过程的竞争性抑制特性使之无法100%阻断DNA链合成，可能会导致部分NAs治疗患者的血清HBV DNA持续或间歇高于检测下限(10 IU/ml或20 IU/ml)，即出现LLV。

4.2 不活跃的肝细胞增殖使cccDNA不能被有效稀释 在肝脏发生炎症性损伤后，感染了HBV的肝细胞同样参与了损伤后的代偿性增殖[37]。由于感染肝细胞内以附加体(episome)形式存在的cccDNA缺乏染色体特有的着丝粒，其在细胞有丝分裂过程中难以有效进入子代细胞新形成的细胞核内，导致子代细胞内cccDNA的丢失和cccDNA池的稀释。德国Dandri实验室的一项研究[38]很好地诠释了这一过程。在他们利用肝细胞人源化小鼠的HBV感染与肝细胞增殖的研究中观察到，感染了HBV的人原代肝细胞在快速代偿性增殖时包括cccDNA拷贝数在内的所有病毒学指标表达均快速下降。相反，随着肝细胞代偿性增殖减慢，上述病毒学标志物开始反弹。与之一致，来自临床的观察研究发现：患者在NAs治疗中，反映肝细胞损伤的ALT升高与更明显的血清HBV DNA载量下降有关[39]，提示有一定肝脏炎症活动度的患者对NAs抗病毒治疗往往有更好的应答。同样，与基线时无明显肝脏炎症(G<2)患者相比，肝脏炎症活动度高的患者(G≥2)在开展抗病毒治疗6个月后的血清HBV DNA和HBeAg下降更为明显[40]。除此之外，在增殖的肝细胞中 NTCP的表达及细胞膜定位的明显下调也不利于HBV的再感染[40]。但是，低增殖状态肝细胞易被HBV感染并利于HBV有效复制，出现cccDNA蓄积[41]。低增殖状态是否与部分接受NAs治疗的CHB患者出现LLV有关，有待更多的临床与基础研究验证。

5 与LLV诊断相关的检验方法学

需要开发更灵敏且准确度更高的HBV DNA检测方法，以更加有效地对LLV患者的血清HBV DNA水平进行监测。并且应对HBV DNA“未检测到”和“HBV DNA存在但低于检测下限”两种结果模式进行区分，后者表示有PCR扩增曲线和痕量DNA存在，只是无法准确定量。此外也应考虑过分片面地强调HBV DNA检测的灵敏度，会导致污染带来的低值阳性结果被误当作LLV，从而给CHB的诊治带来困扰[42]。

6 LLV临床管理策略

AASLD指南建议LLV的CHB患者继续原药物单一治疗，但证据等级很低；并指出没有足够的比较证据支持增加第2种药物或改用另一种药物来代替继续单一治疗[42]。在其更新的指南(2018年)中建议不管ALT水平如何，接受ETV、TDF或TAF单药治疗96周，但持续LLV(<2000 IU/ml)的CHB患者继续单药治疗(证据质量：很低，有条件推荐)[5]。

部分基于真实世界研究[16,43-45]指出，对于依从性好的患者，在ETV治疗期间经历LLV可能没有必要调整抗病毒药物。与此相反，鉴于LLV的潜在危害性，近年来已发表多项对ETV经治的LLV治疗的不同策略的研究，如换用或联合TDF[46-49]、换用TAF[50]或联合PEG-IFNα治疗[51-55]。目前TDF或TAF经治LLV患者改变治疗方案的临床研究尚少。AASLD以外的其他主流CHB管理指南尚未提出针对LLV的管理策略，但多给出了PVR的应对策略，这可能对临床管理LLV患者提供思路。2017年版EASL指南[4]中指出任何NAs都有可能发生PVR。首先需检查患者的依从性。如果患者服用低耐药屏障的药物(LAM、ADV或LdT)，建议换用非交叉耐药的NAs。此外应注意的是，大多数时候高病毒载量患者ETV或者TDF治疗后更易发生PVR。该现象并非药物无效，而与其有限的抑制病毒复制的能力相关。故此，对高病毒载量的患者在48周发生PVR时需要考虑药物动力学：HBV DNA水平持续下降者延长治疗时间可能应答率升高，而且长期治疗耐药风险非常低，可继续原ETV或TDF单一治疗。TAF亦是如此；若HBV DNA不再下降时可换用或加用另一种NA。2018年版AASLD指南[5]仅建议继续ETV或TDF单一治疗。而我国2019版指南[2]推荐应答不佳患者(HBV DNA>2000 IU/ml)调整NAs治疗(应用ETV者换用TDF或TAF，应用TDF或TAF者换用ETV，或两种药物联合使用)(C2)，还建议可以联合PEG-IFNα治疗(B1)。

PEG-IFNα在HBeAg血清学阴转及HBsAg清除方面，比NAs治疗方案更具有优势。但IFN的抗病毒作用相对较弱、耐受性低、不良事件发生风险较高，限制了医生和患者对IFN的使用。因此，如何筛选能获得良好应答的患者成了PEG-IFNα用于临床治疗的关键问题[52]。我国学者早期开展的HBeAg阳性CHB患者ETV与PEG-IFNα-2a联合/序贯治疗的持续应答研究 (OSST研究)，共纳入200例HBeAg阳性CHB患者，入组患者接受ETV治疗9～36个月，且HBV DNA<1000 拷贝/ml、HBeAg<100 PEIU/ml[53-54]。入组患者随机接受换用PEG-IFNα或继续ETV治疗48周，其中换用PEG-IFNα者接受ETV重叠治疗8周。结果发现，高达17.78%(8/45)的优势NA经治患者(基线HBsAg<1500 IU/ml)接受PEG-IFNα序贯治疗96周可获得HBsAg清除[55]。对于NAs治疗应答不佳/耐药的HBeAg阳性CHB患者，前期的一项小样本研究提示，与NAs换药或者加药组相比，在换药或加药基础上进一步联合PEG-IFNα治疗，可明显抑制病毒复制[55]，若研究结果能在大样本临床队列中得以验证，无疑将为LLV的治疗提供新的思路和方法。

7 总结

在NAs治疗后，存在一定比例的LLV患者。其发生的原因可能与NAs竞争性抑制HBV 复制、对cccDNA无直接作用的机制相关。因此，理论上，NAs经治的LLV患者通过换用或加用新的NAs药物难以彻底解决LLV问题。同时，随着更加灵敏的HBV DNA检测试剂和方法的应用，会有更多的LLV被检测出。考虑到LLV可能与肝纤维化的进展、肝硬化甚至肝癌发生相关，加强该方面的基础与临床研究显得越发重要而迫切。

基础研究方面，针对LLV的发生机制，除了上述的NAs药物作用机制的固有缺陷外，是否还有宿主免疫、遗传、肝细胞增殖调控或其他方面的影响？临床研究方面，对于LLV的临床结局，LLV不同HBV DNA水平对肝病进展和预后的影响是否不同？不同预后是否存在相应界值？阐明这些问题有助于制订更合适的HBV DNA定量的PCR检测下限。LLV临床治疗方面，在HBV特效新药研发成功前，如何优化现有治疗方案？NAs维持原方案治疗、换药或加药，或联用PEG-IFNα，哪种方案更有效？联用PEG-IFNα能否在解决LLV的同时，进一步实现临床治愈和减少肝癌发生？由于可能受研究经费和其他因素影响，考虑到临床研究的可行性和效率，是更适宜采用随机对照还是真实世界观察，来开展大样本的、多中心的临床研究？上述诸多问题的解决，不仅有助于奠定彻底解决LLV问题的基础，也可能为新的药物开发提供思路和方法。

志谢参与线上研讨及线下讨论的专家(按姓氏拼音顺序)：陈香梅、成军、段钟平、高沿航、韩涛、胡鹏、黄燕、贾继东、江建宁、李军、林炳亮、刘军平、刘燕娜、吕君、王豪、王晖、王磊、魏来、谢青、徐京杭、余祖江、张大志、张缭云、张欣欣、张跃新。此外，本文还经部分中华医学会肝病学分会肝病基础医学与实验诊断协作组成员共同讨论成文。李德瑶、张鹏参与了文献查阅和整理工作。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：鲁凤民、封波、郑素军、庄辉教授负责构思主要框架及修改文章关键内容；蒋素贞、杨瑞锋、纪冬、党双锁、鲁晓擘、陈红松、陈新月、任红、高志良、南月敏、徐小元、福军亮、牛俊奇、张文宏参与修改文章。