基于网络药理学和分子对接技术探讨桑梅止咳颗粒治疗COPD的作用机制

孙宁 于文晓 袁芳

〔摘要〕 目的 分析桑梅止咳顆粒的有效活性成分及其治疗慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease， COPD）的分子机制。方法 分别通过TCMSP数据库、SymMap数据库、GeneCards数据库查找桑梅止咳颗粒中12味中药的有效活性成分及其靶点蛋白和人类COPD相关的作用靶点，构建有效活性成分-疾病靶点的网络图;蛋白相互作用（PPI）网络通过STRING数据库进行构建，通过Metascape数据库进行GO和KEGG富集分析;最后使用分子对接技术对有效活性成分和靶点进行验证。结果 经过筛选，桑梅止咳颗粒中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素等多个关键活性成分，可能通过作用于白介素6（interleukin-6， IL-6）、白细胞介素-1β（Interleukin-1 beta， IL-1β）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor， TNF）、髓过氧物酶（myeloperoxidase， MPO）、有丝分裂原激活蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14， MAPK14）等核心基因表达的蛋白参与桑梅止咳颗粒的治疗。KEGG 富集分析所涉及的通路包括IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、谷胱甘肽代谢（glutathione metabolism）、Th1和Th2细胞分化（Th1 and Th2 cell differentiation）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、趋化因子信号通路（chemokine signaling pathway）等。选取关键活性成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和PPI核心基因IL-6、TNF、MAPK14进行分子对接。IL-6与槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇的对接能分别为-4.83、-5.74、-4.89 kJ/mol;TNF与槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇的对接能分别为-7.69、-8.57、-7.21 kJ/mol;MAPK14与槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇的对接能分别为-5.0、-5.5、-5.68 kJ/mol。结论 桑梅止咳颗粒可通过多成分、多靶点、多通路的复杂作用机制发挥抗炎作用，进而对COPD起到治疗作用。

〔关键词〕 桑梅止咳颗粒;慢性阻塞性肺疾病;网络药理学;分子对接;作用机制

〔中图分类号〕R285.5       〔文献标志码〕A        〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.12.016

Molecular Mechanism of Sangmeizhike Granule in Treating COPD Based on

Network Pharmacology and Molecular Docking

SUN Ning1， YU Wenxiao2*， YUAN Fang3

（1. Beijing First Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Beijing 100026， China;

2. Department of Andrology， Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China;

3. Beijing Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100069， China）

〔Abstract〕 Objective To analyze active components and molecular mechanism of Sangmeizhike Granule in treating chronic obstructive pulmonary disease （COPD）. Methods The TCMSP database， SymMap database and GeneCards database were used to screen out potential active substances and the targets related to human COPD separately; the network of active substances and disease targets was pictured; protein-protein interaction （PPI） network was built by STRING database platform; GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis were analyzed by Metascape database. Finally， molecular docking technology was used to verify the active ingredients and targets. Results After screening， many key components in Sangmeizhike Granule might be effective for COPD treatment through interleukin-6 （IL-6）， interleukin-1 beta （IL-1β）， tumor necrosis

factor （TNF）， myeloperoxidase （MPO）， mitogen-activated protein kinase 14 （MAPK14）， namely quercetin， kaempferol， beta-sitosterol， luteolin etc. KEGG enrichment analysis results included IL-17 signaling pathway， glutathione metabolism， Th1 and Th2 cell differentiation， HIF-1 signaling pathway， chemokine signaling pathway. The key active ingredients quercetin （MOL000098）， kaempferol （MOL000422）， β-sitosterol （MOL000358） and PPI core genes IL-6， TNF， MAPK14 were selected for molecular docking. The docking energies of IL-6 with quercetin， kaempferol and β-sitosterol were -4.83， -5.74， and -4.89 kJ/mol， respectively; the docking energies of TNF with quercetin， kaempferol and β-sitosterol were -7.69， -8.57， -7.21 kJ/mol; the docking energies of MAPK14 with quercetin， kaempferol and β-sitosterol were -5.0， -5.5， -5.68 kJ/mol， respectively. Conclusion Sangmeizhike Granule can treat COPD through the complex action mechanism of multiple components， multiple targets and multiple pathways by anti-inflammatory.

〔Keywords〕 Sangmeizhike Granule; chronic obstructive pulmonary disease; network pharmacology; molecular docking;

mechanism of action

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary

disease， COPD）是一种与呼吸道慢性炎症增强及其相关的肺部疾病[1]。COPD常伴有肺功能的异常下降，慢性呼吸衰竭是COPD患者的主要死亡原因。目前临床上治疗COPD多采用支气管扩张药物和抗炎药物，但药物种类少，且有些药物在上市后因嚴重不良反应被叫停[2]。由于COPD病程长且易反复，患者需要长期用药，增加了药物不良反应的发生率，长期使用极易诱发COPD并发症[3]。

COPD属于中医学“咳嗽”“喘证”“肺胀”的范畴[4]。中医理论认为肝气横逆、肺气郁闭乃喘证的主要病机。根据其病机特点，崔红生教授采用桑梅止咳颗粒这一经验方对COPD进行了临床治疗研究。研究结果表明，使用桑梅止咳颗粒联合布地奈德和复方异丙托溴铵治疗COPD具有很好的疗效，能够显著降低气道炎症反应，缓解气管痉挛[5]。本文针对桑梅止咳颗粒的分子机制进行探讨，通过网络药理学和分子对接技术对其有效成分和相关靶点进行分析，为进一步的实验和临床研究提供依据。

1 资料与方法

1.1  桑梅止咳颗粒有效活性成分筛选

桑梅止咳颗粒方中主要包括桑白皮、乌梅、桑叶、菊花、桔梗、苦杏仁、白芍、炙枇杷叶、五味子、白僵蚕、蝉蜕、甘草。在中药系统药理学数据库分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology

database and analysis platform， TCMSP）和SymMap数据库中查询10味中药中的有效活性成分。使用生物利用度（OB≥30%）和药物相似性（DL≥0.18）两个指标进行筛选，筛选出的有效活性成分具有较好的口服吸收效果和较高的成药性。

1.2  桑梅止咳颗粒与COPD的共同作用靶点筛选

使用“1.1”项中筛选出的有效活性成分，找出其所对应的靶点蛋白。通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）下载人类基因名称和对应的靶点蛋白，对有效活性成分的靶点蛋白和人类基因名称进行转化;COPD靶点基因由GeneCards数据库（https：//www.GeneCards.org/）检索得出;将有效活性成分的靶点蛋白与COPD基因进行映射，获取药物-疾病所共有的靶点基因，并找出这些基因对应的关键化学成分。

1.3  关键化学成分-共同靶点网络构建

将共同靶点基因和其相对应的关键化学成分整理成表格文件，随后将该文件导入Cytoscape 3.7.2软件绘制关键化学成分和共同靶点基因的关系网络图。

1.4  蛋白相互作用（PPI）网络构建

PPI网络可以形象地描述疾病与药物共同基因之间的相互作用关系。将“1.2”中筛选得到的基因输入STRING数据库（https：//string-db.org），得到PPI网络。进一步设置PPI的评分为0.9，优化该网络关系图。下载PPI的具体数据，筛选出排名前15的PPI网络核心基因互作对。

1.5  GO富集分析和KEGG富集分析

在Metescape数据库（http：//metascape.org/gp/index.html）中输入共同靶点基因，设置P=0.01，最小交叠值=3，最小富集度=1.5，分别进行GO生物过程和KEGG功能富集。使用ImageGP网站在线作气泡图。应用Cytoscape软件绘制桑梅止咳颗粒治疗COPD的靶点-信号通路网络图。

1.6  分子对接

下载关键化学成分结构后使用Chemdraw软件对其进行3D优化。通过PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）下载靶点蛋白的结构，并使用Pymol软件进行常规预处理。随后使用Autodock软件进行分子对接，对接参数均为默认值。

2 结果

2.1  桑梅止咳颗粒有效活性成分分析

桑梅止咳颗粒由桑白皮、乌梅、桑叶、菊花、桔梗、苦杏仁、白芍、炙枇杷叶、五味子、白僵蚕、蝉蜕、甘草12味中药组成，根据其OB、DL筛选出200个活性成分，其中未筛选到白僵蚕的活性成分。部分主要成分见表1。

2.2  桑梅止咳颗粒-COPD靶点预测

从GeneCard数据库下载并筛选与COPD相关评分大于等于5的基因，共有85个基因。将筛选后的COPD与桑梅止咳颗粒的靶点映射，得到两者的共同基因为26个，绘制Venn图。见图1。

2.3  桑梅止咳颗粒中活性成分与COPD基因网络构建

使用Cytoscape软件构建桑梅止咳颗粒中的关键活性成分和COPD靶点基因的关系网络图。其中，方框代表桑梅止咳颗粒中的化合物;在外部呈环形的代表靶点基因，标签中的文字大小以“degree”表示。排名前5位的关键化学成分如下：槲皮素（MOL000098，

degree=96）、山柰酚（MOL000422，degree=49）、β-谷甾醇（MOL000358，degree=18）、木犀草素（MOL000006，

degree=16）以及（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯（MOL006821，degree=6）。排名前15位的共有靶点基因依次如下：MAPK14、ADRB2、GSTP1、CHRM3、MMP1、TNF、HMOX1、SLC6A4、GSTM1、CYP1A1、IL-6、MMP9、IL-10、CXCL8、SLPI。见图2。

2.4  PPI网络分析

将桑梅止咳颗粒和COPD共同的靶点基因输入STRING数据库，即可得到PPI网络（图3）。由图可知，该PPI网络中包含26个节点、166条边。其中PPI评分等于0.99的互作蛋白为ELANE—SLPI、IL-10—IL-6、IL-10—TNF、MMP9—TIMP1、CXCL8—IL-10、IL-10—IL-1β、IL-4—IL-6、CCL2—IL-10、ELANE—MPO、MMP1—TIMP1、CXCL8—IL4、CXCL8—IL-1β、IL-4—TNF、CCL2—IL-4、CXCL10—IL-10和IL-1β—IL-4。通過计算基因连接点的数目，得到排名前15位的PPI核心基因为：IL-6、IL-1β、TNF、MAPK 14、MPO、HMOX1、IL10、CXCL8、IL4、ELANE、MMP9、TIMP1、CCL2、MMP1、CXCL10。这些基因是桑梅止咳颗粒治疗COPD的核心基因。见图4。

2.5  GO功能富集分析

生物过程（biological process， BP）富集分析结果如图5所示，主要包括脂多糖应答、骨髓样白细胞的激活、白细胞迁移、趋化因子产生的调节、细胞因子产生调节、活性氧种类的代谢过程、细胞外基质的分解、I-kappaB激酶/NF-kappaB信号的调控、病毒基因组复制、超氧化物代谢过程等。

2.6  KEGG通路富集分析

对桑梅止咳颗粒和COPD的共同靶点进行KEGG通路富集分析，主要的通路包括IL-17信号通路、谷胱甘肽代谢、Th1和Th2细胞分化、HIF-1信号通路、趋化因子信号通路等。见图6。

2.7  靶点-通路网络构建

绘制的靶点-通路网络图见图7。筛选出的核心靶点分别TNF、MAPK 14、IL-6、IL-1β、IL-10等。

2.8  分子对接结果

本研究采用排名前3位的关键活性成分槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422）、β-谷甾醇（MOL000358）和PPI核心基因IL-6、TNF、MAPK 14进行分子对接，最佳作用模式结果见图8-10。IL-6与槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇的对接能分别为-4.83、-5.74、-4.89 kJ/mol;TNF与槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇的对接能分别为-7.69、-8.57、-7.21 kJ/mol;MAPK 14与槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇的对接能分别为-5.0、-5.5、-5.68 kJ/mol;表明这3个活性成分与受体结合能力强，可能是桑梅止咳颗粒治疗COPD的主要作用成分。

3 讨论

桑梅止咳颗粒方中君药为味酸涩、性收敛之乌梅，能入肝、脾、肺经，功善敛肺止咳;臣药为性苦寒之桑白皮和桑叶，走肺络而降火润燥，泻肺平喘，桑梅合用为酸收甘缓之法，可挽虚亢之脱。僵蚕与蝉蜕为搜风入络之虫药，僵蚕能化顽痰，蚕蜕能清肝肺之热，具有良好的解痉作用。白芍、五味子、甘草是滋阴敛肺之药对，佐桑梅进一步发挥酸甘收缓之功。苦杏仁、炙枇杷叶下气平喘，苦寒清肃肺气兼以润肺。全方基于“厥阴风木”理论，蕴含“清、宣、透、润”四法，可有效治疗COPD带来的肺气上逆之证候。实验研究表明，桑梅止咳颗粒可以有效减轻患者炎症反应，缓解气道阻力和降低肺损伤[5]，故本文进一步对其疗效的分子机制进行探讨。

结果表明，桑梅止咳颗粒中含有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素等多个关键活性成分，其靶点与COPD基因匹配较好。槲皮素是一种黄酮类化合物，可有效地降低气道炎症[6]。研究[7]表明，其能通过激活cAMP/PKA信号通路，抑制NF-κB的活化，可用于预防急性加重慢性阻塞性肺疾病。山柰酚可以抑制氧化-抗氧化平衡失调，对抗小鼠肺部炎症，显著降低肺组织损伤[8]。有报道证明，β-谷甾醇可以阻止炎症因子释放、下调NF-κB通路的活化[9]，止咳平喘，治疗支气管炎症[10]。木犀草素较好的抑制IL-6、IL-12等炎症因子，并能有缓解患者的呼吸困难，对COPD的防治具有较好的临床效果[11-12]。

本研究结果显示，IL-6、IL-1β、TNF、MAPK14、MPO等是桑梅止咳颗粒治疗COPD的核心基因。IL-6是急性期反应的有效诱导剂，IL-6的快速产生有助于感染和组织损伤期间的宿主防御[13]。有研究[14]表明，IL-6水平是预测COPD急性加重的有效指标，对COPD疾病进程起重要作用。血清中TNF水平与肺部炎症密切相关，降低TNF水平可显著缓解COPD患者的症状[15]。研究[16]表明，MAPK信号通路的激活参与PGF介导的TSC（结节性硬化症复合物）通路和肺上皮细胞中的自噬调节，MAPK14信号通路是治疗肺气肿和COPD的潜在治疗靶点。COPD患者的血清MPO水平与患者病程发展相关，是指导治疗和判断预后的重要指标[17]。

KEGG信号通路富集分析表明，桑梅止咳颗粒可能作用在多通路上，如IL-17信号通路、Th1和Th2细胞分化、HIF-1信号通路、趋化因子信号通路。其中，IL-17是强大的前炎症因子，IL-17家族通过其相应的受体发出信号，并激活下游的NF-κB、MARK等信号通路，诱导细胞因子、趋化因子的表达，与呼吸系统疾病、心血管疾病等发生密切相关[18]。研究表明，IL-17在COPD患者中显著高表达，是多种药物的治疗靶点[19]。HIF-1是一种转录因子，在缺氧条件下充当众多缺氧诱导基因的主要调节因子，HIF-1的靶基因可编码蛋白，该蛋白可以增加O2输送和介导对O2剥夺适应反应，与炎症反应密切相关[20]。与上述信号通路较为匹配的基因为TNF、MAPK14、IL-6、IL-1β、IL-10等，由此可见桑梅止咳颗粒可通过上述靶点在相关通路上调控炎症反应，从而缓解气道痉挛，治疗COPD。

桑梅止咳颗粒中含有的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素等多种活性物质，可以直接作用于TNF、MMP1、MMP9、IL-6、IL-1β、IL-10等炎症密切相关受体上，这些受体是IL-17信号通路参与炎症炎症反应的重要炎症因子，其中，CCL2还在HIF-1信号通路中起重要作用，是炎症诱导的局部组织缺氧的重要中间介质[20]。由上述结果可以看出，桑梅止咳颗粒主要作用于炎症相关受体，通过IL-17信号通路、HIF-1信号通路而发挥抗炎作用，从而有效地治疗或延缓COPD病程。

综上所述，桑梅止咳颗粒可通过多种活性成分，作用在多靶点上，通过多通路的较为复杂的作用起到治疗COPD的作用。本研究为桑梅止咳颗粒的作用机制提供了理论基础，在接下来的研究中可以重点考察桑梅止咳颗粒中关键化学成分对于TNF、IL-6、IL-1β的作用及其对IL-17信号通路、HIF-1信号通路的影响。

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〔收稿日期〕2021-06-21

〔基金项目〕国家自然科学基金面上项目（81273689）。

〔作者簡介〕孙  宁，女，主治医师，博士，研究方向：中医治疗呼吸系统疾病。

〔通信作者〕*于文晓，男，主治医师，E-mail：ee66gg@163.com。