猪大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌的多重实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

刘嘉琳，刘东旭，董文龙，李国江*

(1．吉林农业大学 动物科学技术学院， 吉林 长春 130118； 2．吉林农业科技学院 动物科技学院， 吉林 吉林市 132109； 3．吉林省预防兽医学重点实验室， 吉林 吉林市 132109)

猪腹泻病是导致仔猪死亡的主要原因之一，严重影响了饲料报酬，制约养猪业的健康发展。其中大肠杆菌、沙门菌和产气荚膜梭菌是引起猪细菌性腹泻病的主要病原。大肠杆菌某些致病血清型菌株可致仔猪黄白痢、猪水肿病，临床上以肠炎、肠毒血症为特征[1-3]；沙门菌主要感染1～4月龄猪，猪沙门菌病又名猪副伤寒,临床上分为急性、亚急性和慢性型，急性型以败血症为特征，亚急性和慢性型以坏死性肠炎为特征；产气荚膜梭菌亦称魏氏梭菌，引起仔猪坏死性肠炎，以肠道出血为特征，表现为红色下痢。猪细菌性腹泻一年四季都有可能发生，既可单一感染，也可相互混合感染。因此，本试验针对大肠杆菌irp2基因[4]、沙门菌fimY基因[5]、产气荚膜梭菌plc基因[6]设计特异性引物和探针并优化反应条件，建立了同时检测并区分这3种细菌的多重实时荧光定量PCR检测方法，为这3种细菌的检测提供了有效手段。

1 材料与方法

1.1 菌株及临床样品的采集多动物链球菌、猪链球菌、乳酸乳球菌、金黄色葡萄球菌、海氏肠球菌、绿色气球菌、多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯菌、鼠伤寒沙门菌、洛菲不动杆菌、溶血曼氏杆菌、HPI+大肠杆菌、大肠杆菌标准株ATCC25922、产气荚膜梭菌等由实验室保存。猪粪便样本采集于吉林地区猪场表现出腹泻症状的猪，称取100 mg置于灭菌离心管中保存于-80℃超低温冰箱。

1.2 主要试剂及仪器粪便基因组DNA提取试剂盒，购自Solarbio；细菌基因组小量纯化试剂盒、Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye )、凝胶回收试剂盒、pMD18-T Vector、DH5α大肠杆菌感受态、质粒DNA 小量纯化试剂盒、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR )等，均购自宝生物工程(大连)有限公司。梯度PCR仪，购自上海皓庄仪器有限公司；实时荧光定量PCR仪，购自AnalytikJena；核酸蛋白测定仪，购自Eppendorf。

1.3 引物及探针根据GenBank登录的大肠杆菌、沙门菌、产气荚膜梭菌基因序列，针对大肠杆菌irp2基因，沙门菌fimY基因，产气荚膜梭菌plc基因设计特异性引物及不同荧光基团标记的探针(表1)，由吉林省库美生物科技有限公司合成。

表1 大肠杆菌、沙门菌、产气荚膜梭菌特异性引物及探针序列

1.4 标准品阳性质粒的制备利用粪便基因组DNA提取试剂盒提取临床采集的粪便样本DNA作为模板，用合成的特异性引物进行PCR扩增，回收并纯化PCR产物。将pMD18-T Vector与回收纯化产物连接，连接产物转化至DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆接种于4 mL含4 μL AMP LB液体培养基中培养，使用质粒DNA小量纯化试剂盒进行重组质粒的提取并进行PCR鉴定，阳性重组质粒送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序，结果与GenBank中相关核酸序列BLAST比对分析。测定阳性重组质粒浓度，按公式将浓度转化为拷贝数，作为标准模板保存于-80℃超低温冰箱备用。

拷贝数(拷贝/μL)=[ 6.02×1023×质粒浓度(mg/ L) ×10-9]/(质粒分子碱基数× 660)

1.5 反应条件的优化在RT-qPCR扩增反应体系中，将退火温度设置为54.3,54.4,54.6,55.0,55.4,55.8,56.2,56.6,57.0,57.4,57.6和57.7℃，选择Ct值最小的温度作为最佳退火温度。

将上下游引物和探针终浓度分别设置为0.1,0.2,0.3和0.4 μmol/L进行RT-qPCR扩增反应，选择最佳终浓度。

1.6 标准曲线的建立质粒10倍梯度稀释后，选取9.28×103～9.28×107拷贝/μL质粒混合后作为标准模板，设置3组平行对照组，利用建立的三重RT-qPCR检测方法，绘制标准曲线。

1.7 灵敏性试验以浓度梯度为9.28×100～9.28×107拷贝/μL的标准质粒混合后作为模板，设立阴性对照，利用建立的三重RT-qPCR检测方法和常规PCR扩增，确定检测方法的灵敏性。

1.8 特异性试验使用细菌基因组小量纯化试剂盒提取多动物链球菌、猪链球菌、乳酸乳球菌、金黄色葡萄球菌、海氏肠球菌、绿色气球菌、多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯菌、鼠伤寒沙门菌、洛菲不动杆菌、溶血曼氏杆菌、HPI+大肠杆菌、大肠杆菌标准株ATCC25922、、产气荚膜梭菌DNA。利用建立的三重RT-qPCR检测方法以上述DNA为模板，大肠杆菌标准阳性质粒、沙门菌标准阳性质粒、产气荚膜梭菌标准阳性质粒为阳性对照，灭菌水为阴性对照进行检测，验证其特异性。

1.9 重复性试验以浓度梯度为9.28×104～9.28×106拷贝/μL的标准质粒混合后作为模板，按建立的RT-qPCR检测方法进行组内和组间的扩增反应，每个样本做5个重复检测，计算Ct值的标准差及变异系数。

1.10 临床样品的检测利用建立的大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌三重RT-qPCR检测方法及普通PCR对采集的粪便样本进行检测，比较2种方法的符合率。普通PCR反应体系如下：Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye )12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板2 μL，灭菌水8.5 μL。反应程序为：95℃ 2 min；95℃ 30 s，54.4℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 7 min；4℃ forever。

2 结果

2.1 标准品阳性质粒的制备提取临床采集的粪便样本DNA作为模板，用特异性引物进行PCR扩增，获得大肠杆菌irp2基因(140 bp)、fimY基因(119 bp)、plc基因(115 bp)片段，与目的片段大小一致。经PCR及测序鉴定，结果显示与预期一致(图1)。结果表明成功构建了3种重组质粒，命名为 pMD18-irp2、 pMD18-fimY、 pMD18-plc，检测质粒质量浓度分别为288.2,95.1,134.4 mg/L，换算成拷贝数分别为9.28×1010,3.09×1010,4.37×1010拷贝/μL。将其作为质粒标准品保存于-80℃超低温冰箱备用。

M.DL500 DNA Marker；1.大肠杆菌(140 bp)阳性质粒； 2.沙门菌(119 bp)阳性质粒；3.产气荚膜梭菌(115 bp)阳性质粒；4.大肠杆菌阴性对照；5.沙门菌阴性对照；6.产气荚膜梭菌阴性对照图1 大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌电泳

2.2 RT-qPCR反应体系建立及优化三重RT-qPCR反应体系经优化确定为25 μL：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR )12.5 μL，大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌上下游引物(10 μmol/L)各0.75，1，1 μL(终浓度分别为0.3，0.4，0.4 μmol/L)，大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌探针(10 μmol/L)各1，0.75，1 μL(终浓度分别为0.4，0.3，0.4 μmol/L)，模板2 μL，灭菌水2.25 μL。反应程序为：95℃ 30 s；95℃ 5 s，54.4℃ 30 s并收集荧光信号，39个循环(图2)。

图2 大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌三重RT-qPCR 不同退火温度扩增曲线

2.3 标准曲线绘制将pMD18-irp2、 pMD18-fimY、 pMD18-plc质粒标准品10倍稀释成9.28×103～9.28×107copies/μL，等比例混合均匀后取2 μL作为模板，利用大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌三重RT-qPCR扩增，扩增曲线及标准曲线如图3。结果显示，在9.28×103～9.28×107拷贝/μL浓度范围内，所得拷贝数(x)与Ct 值(y)的线性方程如下：大肠杆菌，y=-3.45x+35.09，R2=0.994，E=0.95；沙门菌，y=-3.35x+36.57，R2=0.997，E=0.99；产气荚膜梭菌，y=-3.49x+34.39，R2=0.995，E=0.94，具有良好的线性关系。

A.大肠杆菌标准曲线；B.沙门菌标准曲线；C.产气荚膜梭菌标准曲线图3 大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌三重RT-qPCR 103～107 拷贝/μL浓度标准模板标准曲线

2.4 灵敏性试验将pMD18-irp2、pMD18-fimY、pMD18-plc质粒标准品10倍稀释成9.28×100～9.28×107拷贝/μL，等比例混合作为模板进行灵敏性试验。结果显示，在Ct值<35范围内，此检测方法对pMD18-irp2、pMD18-fimY、pMD18-plc检测下限分别为9.28×103，3.09×10,和4.37×103拷贝/μL(图4)，表明此检测方法具有较好的灵敏性。

A.大肠杆菌灵敏性试验扩增曲线；B.沙门菌灵敏性试验扩增曲线；C.产气荚膜梭菌灵敏性试验扩增曲线;3.pMD18-plc；4.鼠伤寒沙门菌DNA；5.产气荚膜梭菌DNA；6.HPI+大肠杆菌DNA图4 大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌三重RT-qPCR 107 拷贝/μL～100 拷贝/μL灵敏性试验扩增曲线

2.5 特异性试验以多动物链球菌、猪链球菌、乳酸乳球菌、金黄色葡萄球菌、海氏肠球菌、绿色气球菌、多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯菌、鼠伤寒沙门菌、洛菲不动杆菌、溶血曼氏杆菌、HPI+大肠杆菌、大肠杆菌标准株ATCC25922、产气荚膜梭菌DNA为模板，pMD18-irp2、pMD18-fimY、pMD18-plc为阳性对照，灭菌水为阴性对照，利用建立的三重RT-qPCR检测方法进行特异性试验。结果表明，HPI+大肠杆菌、沙门菌、产气荚膜梭菌DNA及阳性对照出现特异性扩增曲线，其余细菌DNA及阴性对照无扩增曲线出现(图5)，表明建立的大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌三重RT-qPCR检测方法具有良好的特异性。

1.pMD18-irp2；2.pMD18-fim Y；3.pMD18-plc；4.鼠伤寒沙门菌DNA；5.产气荚膜梭菌DNA；6.HPI+大肠杆菌DNA；7.大肠杆菌标准株DNA；8.多动物链球菌；9.猪链球菌DNA；10.乳酸乳球菌DNA；11.金黄色葡萄球菌DNA；12.海氏肠球菌DNA；13.绿色气球菌DNA；14.多杀性巴氏杆菌DNA；15.肺炎克雷伯菌DNA；16.洛菲不动杆菌DNA；17.溶血曼氏杆菌DNA；18.阴性对照图5 大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌三重RT-qPCR 特异性试验扩增曲线

2.6 重复性试验将pMD18-irp2、 pMD18-fimY、 pMD18-plc质粒标准品10倍稀释成9.28×104～9.28×106拷贝/μL，等比例混合作为模板进行重复性试验。结果表明，组间及组内重复性试验Ct值变异系数均在5%以下(表2)，表明此检测方法具有较好的重复性。

表2 重复性试验结果

2.7 临床样品的检测利用所建立的多重荧光定量RT-PCR方法，对采集自吉林地区112份临床样品进行检测，同时利用建立的大肠杆菌、沙门菌、产气荚膜梭菌多重荧光定量PCR方法及普通PCR方法对相同病料进行检测(图6)。结果表明本试验所建立的多重荧光定量RT-PCR比普通PCR具有更强的灵敏性，可以用于临床检测(表3)。临床检测结果中存在3种病原的相互混合感染，需要加以重视。

表3 临床样品检测结果

图6 大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌三重RT-qPCR 临床样品检测

3 讨论

大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌是导致仔猪细菌性腹泻的主要病原，临床上常出现混合感染，且细菌耐药性增强，为临床诊断及治疗造成一定阻碍。大肠杆菌可引起仔猪黄痢及仔猪白痢，近些年HPI被认为是大肠杆菌重要的毒力因子之一,可以显著提高大肠杆菌的致病性,其中irp2为主要标志基因,对于细菌毒力的发挥都起着至关重要的作用[7]。吕殿红等[8]在广东地区养殖场分离携带irp2基因HPI+大肠杆菌阳性率为28%，南文金等[9]在粤北地区大肠杆菌HPI相关毒力因子中检出irp2基因阳性率为21.43%，路振香等[10]从病料样本中分离的13株病原菌中12株均为产肠毒素大肠杆菌并且均含有HPI。沙门菌主要引起仔猪副伤寒，主要症状表现为顽固性下痢，粪便黄绿色水样，2009和2012年山东省猪源沙门菌分离率为10%[11]，广西地区11个规模化猪场采集的99份病料中分离到21株沙门菌，分离率为21%[12]。焦连国[13]在2014-2018年采集到的全国26个省市123家规模化猪场的806份样本中分离得到沙门菌173株，分离率为21.46%，以鼠伤寒沙门菌为主，主要分布在河北、山东、湖南、湖北、重庆等省市。产气荚膜梭菌主要引起仔猪红痢，主要症状为坏死性肠炎及肠毒血症，病程短，病死率高，王海荣[14]在从山东多地采集的来源于不同动物的689份粪便样本中分离131株产气荚膜梭菌，均为A型，其中猪源产气荚膜梭菌为31株。

通过应用本试验建立的多重荧光定量PCR检测方法，对吉林地区规模化猪场采集的粪便样本进行检测，大肠杆菌irp2基因、沙门菌、产气荚膜梭菌阳性率分别为58.9%，7.1%，7.1%，大肠杆菌及沙门菌混合感染率为1.8%，大肠杆菌及产气荚膜梭菌混合感染率为5.4%，表明携带HPI的大肠杆菌在致仔猪腹泻病原中占比越来越高，沙门菌检出率较往年有所下降，产气荚膜梭菌则呈上升趋势[15]，在猪养殖中要注意消毒，预防疾病发生。

目前国内外可以同时检测大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌的方法很少，本试验建立了一种可以同时检测这3种病原的多重实时荧光定量PCR检测方法，具有较好的特异性、敏感性和重复性，耗时不超过3 h，适用于实验室快速诊断。