石榴叶总黄酮的提取及体外抗氧化性研究

◎ 侯笑林，于珺妃

（青岛工学院食品工程学院，山东 青岛 266300）

石榴叶包括熊果酸、甘露醇、没食子酸、黄酮苷类等20多种化合物，具有抗心血管疾病、消除自由基及抗氧化、抗骨质疏松、防癌抗癌等作用[1]。黄酮类化合物具有清除氧自由基、改善血液循环、降低胆固醇、抗癌、抗肿瘤作用等多种医疗保健功能[2]。石榴叶很少被运用到生产加工中，少部分被当作药材应用，大部分成为废弃物，资源利用率低。黄酮类物质传统提取方法是乙醇浸提法，但其提取时间长、提取率低，且在体外抗氧化性能方面研究较少[3]。本文对石榴叶黄酮类物质的乙醇提取工艺和抗氧化性进行了初步试验研究。

1 材料与方法

1.1 材料

石榴叶（郊区采摘，新鲜无虫害）；95%乙醇；芦丁标准品；L-抗坏血酸；DPPH；硝酸铝等。

1.2 设备

GM-B2002电子天平；DHG-9240A型BS电热恒温鼓风干燥箱；722N可见分光光度计；多功能粉碎机；超声波清洗器；数显恒温水浴锅HH-6等。

1.3 试验方法

1.3.1 提取流程

石榴叶→洗净→烘干→粉碎、过筛→称取石榴叶粉→按料液比加入乙醇溶液→超声→离心、抽滤→蒸发浓缩→乙醇定容→制备黄酮提取液→测吸光度。

1.3.2 操作要点

（1）原料预处理。挑选新鲜、无虫蚀石榴叶，洗净，60 ℃烘干，粉碎，石油醚浸提除去脂溶性杂质。脱去石油醚，再次粉碎，过筛，干燥保存。

（2）石榴叶总黄酮提取。称取石榴叶粉，按一定料液比加入一定体积分数的乙醇溶液，摇匀，保鲜膜封口，一定温度下超声提取一定时间，离心。滤液用70%乙醇定容，得总黄酮提取液。

1.3.3 石榴叶总黄酮含量测定及提取率计算

采用硝酸铝比色法，以试剂空白为参比，于510 nm波长处测定吸光度，以芦丁标准浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，制作标准曲线，得到标准曲线的回归方程。吸取待测液，按上述方法测吸光度，计算提取液中总黄酮（以芦丁计）含量。

总黄酮提取率（mg·g-1）=（测得总黄酮浓度×体积×稀释倍数）/石榴叶粉末称样量

1.3.4 单因素试验

（1）乙醇体积分数对石榴叶总黄酮提取率的影响。准确称取2.00 g石榴叶粉，按照1∶20料液比分别加入体积分数为40%、50%、60%、70%和80%的乙醇溶液，60 ℃超声提取30 min，以总黄酮提取率为指标进行评定，确定最佳乙醇体积分数。

（2）料液比对石榴叶总黄酮提取率的影响。准确称取2.00 g石榴叶粉，分别按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30（g·mL-1）加入最佳体积分数的乙醇溶液，60 ℃超声提取30 min，以总黄酮提取率为指标进行评定，确定最佳料液比。

（3）超声时间对石榴叶总黄酮提取率的影响。准确称取2.00 g石榴叶粉，按最佳料液比加入最佳体积分数的乙醇溶液，提取温度60 ℃，分别设定超声时间为10 min、20 min、30 min、40 min和50 min，以总黄酮提取率为指标进行评定，确定最佳超声提取时间。

（4）超声温度对石榴叶总黄酮提取率的影响。准确称取2.00 g石榴叶粉，按最佳料液比加入最佳体积分数的乙醇溶液，在最佳超声时间条件下分别设置超声温度40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃，以总黄酮提取率为指标进行评定，确定最佳超声温度。

1.3.5 正交试验因素

根据单因素试验结果，选取A乙醇体积分数，B料液比，C超声提取时间，D超声提取温度为4个影响因素，以总黄酮提取率为测定指标，进行正交试验设计，正交试验因素水平设计，如表1所示。

表1 L9(34)正交试验因素水平表

1.3.6 石榴叶总黄酮抗氧化性的测定

（1）羟自由基（•OH）清除率的测定[4]。取1.0 mL不同质量浓度样品溶液于比色管中，分别加入3 mL 7.5 mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液、3 mL磷酸盐缓冲液（pH值=7.4）、2 mL 0.75 mmol·L-1FeSO4以及2 mL 0.01%双氧水，混匀，37 ℃水浴30 min，于510 nm处测吸光值，以相同浓度VC进行对比。羟自由基（•OH）清除率的计算如下。

清除率P=[1-(Ax-A0)/Ax0]×100%

其中：A0-空白对照液的吸光度；Ax-加入样品溶液后的吸光度；Ax0-不加显色剂H2O2样品溶液的吸光度。

（2）DPPH自由基清除率的测定[5]。取不同质量浓度样品溶液4 mL于试管中，依次加入4 mL 0.2 mmol·L-1DPPH溶液，25 ℃水浴中反应20 min，在517 nm处测定吸光度(Ax)。以蒸馏水作为空白。以相同浓度VC进行对比。DPPH自由基清除率的计算如下。

清除率P=[1-(A1-A2)/A3]×100%

其中：A1-1 mL样液+2 mL DPPH对应吸光度值；A2-1 mL样液+2 mL95%的乙醇对应吸光度值；A3-1 mL蒸馏水+2 mL DPPH对应吸光度值。

2 结果与分析

2.1 乙醇体积分数对石榴叶总黄酮提取率的影响

由图1可知，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮提取率呈现先上升后下降趋势。当乙醇体积分数为60%时，总黄酮提取率最大，为5.36 mg·g-1。黄酮由于其极性和化学性质不同，导致部分水溶、部分醇溶，且在体积分数为60%时均能最大程度溶出。随后，高浓度乙醇使细胞内蛋白质凝固，其他醇溶性杂质、色素溶出量增加，导致提取率下降。因此，乙醇体积分数60%为最佳。

图1 乙醇体积分数对石榴叶总黄酮提取率的影响图

2.2 料液比对石榴叶总黄酮提取率的影响

由图2可知，当总黄酮提取率在料液比为1∶15时，总黄酮提取率达到最大，为2.95 mg·g-1。这是因为随着溶剂量的增加，物料与溶剂的接触面积随之增加，有效成分浓度降低，与物料及溶剂边界层的有效成分浓度差增大，扩散推动力增大，溶出充分。若料液比过大，杂质过多溶出，提取率降低。因此最佳料液比为1∶15。

图2 料液比对石榴叶总黄酮提取率的影响图

2.3 超声时间对石榴叶总黄酮提取率的影响

由图3可知，随着超声提取时间的增加，总黄酮提取率先增大后逐渐减小，当超声提取时间为20 min时，总黄酮提取率达到最大，4.78 mg·g-1。这是由于超声处理提高了颗粒内部的温度和压力，使细胞壁孔径增加，由内而外扩散逐渐趋于饱和。但超声时间延长，空化作用、机械振动作用导致细胞破裂完全，非有效成分进入提取液，影响有效成分溶出，同时热效应致使黄酮结构遭到破坏，提取率下降。

图3 超声提取时间对石榴叶总黄酮提取率的影响图

2.4 超声温度对石榴叶总黄酮提取率的影响

由图4可知，当超声温度在70 ℃时，总黄酮提取率达到最高，为3.47 mg·g-1。这是由于随着超声温度的升高，分子运动速度加快，有效成分渗透和溶解速度加快，提取率升高；当温度超过70 ℃时，容易造成黄酮类物质化学结构发生变化，且杂质溶出量增加，给后续操作带来不便，还会造成溶剂损失。因此超声温度应控制在70 ℃。

图4 超声温度对石榴叶总黄酮提取率的影响图

2.5 正交试验

由表2可知，试验中影响石榴叶总黄酮提取率效果的因素大小顺序为：乙醇体积分数＞超声提取时间＞超声提取温度＞料液比，由k值得到的最佳组合为A2B2C3D2；正交试验表得出的最佳组合为A2B2C3D1，故需进行验证试验。通过验证试验，在A2B2C3D2组合条件下，得到总黄酮提取率为6.23 mg·g-1，高于A2B2C3D1组合，因此，确定石榴叶总黄酮最佳提取工艺为：乙醇体积分数60%，料液比1∶15，超声时间30 min，提取温度70 ℃。

表2 L9(34)正交试验结果分析表

2.6 石榴叶总黄酮对·OH清除率的影响

由图5可知，在0.1～0.6 mg·mL-1浓度范围内，VC与石榴叶总黄酮对•OH的清除率均随浓度的增大而升高，且在相同浓度条件下，总黄酮对•OH清除率均高于VC。当总黄酮浓度为0.4 mg·mL-1时，清除率达到最大，为60.94%；之后当黄酮浓度继续上升，清除率变化不大，而VC对•OH的清除率在浓度为0.5 mg·mL-1时清除率为56.72%，可见石榴叶总黄酮较VC对•OH清除效果更为明显。

图5 石榴叶总黄酮及Vc对•OH清除率的影响图

2.7 石榴叶总黄酮对DPPH·清除率的影响

由 图6可 知，在0.1～0.6 mg·mL-1浓 度 范 围内，总黄酮与VC对DPPH•清除率均随着浓度的增大而升高，抗氧化能力不断增强。当黄酮质量浓度为0.5 mg·mL-1时，黄酮对DPPH•的清除率达到最大，为28.71%，但此时VC对DPPH•的清除率可达38.99%，且在整个浓度范围内，总黄酮的清除效果均低于VC，可见VC对DPPH•的清除效果更强。

图6 石榴叶总黄酮及Vc对DPPH•清除率的影响图

3 结论

以总黄酮提取率为指标，通过正交试验优化石榴叶总黄酮提取工艺，其最佳条件为：乙醇体积分数60%，料液比1∶15，超声提取时间30 min、超声提取温度70 ℃，石榴叶总黄酮提取率达6.23 mg·g-1。石榴叶总黄酮对•OH和DPPH•均表现出一定的清除能力，在一定浓度范围内，清除能力随着黄酮浓度的增加而增强，且具有明显的量效关系；在相同浓度条件下，石榴叶总黄酮对•OH的清除效果优于VC，但对DPPH•的清除效果低于VC。