不同产地葛根提取物中葛根素含量测定

◎ 黄绮敏，刘贤钊，冯华业，江志鹏，黄照荣

（无限极（中国）有限公司，广东 江门 529100）

葛根是豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根[1]。葛根提取物是以葛根为原料，经水提取、过滤、浓缩、干燥等工序制成的提取物。葛根提取物中含有葛根素等成分。葛根具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络和解酒毒的作用[2-6]。国内外目前均未有葛根提取物的官方质量评价方法。本研究建立了葛根提取物中葛根素含量测定方法，测定了不同产地的葛根提取物中葛根素含量，为初步评价葛根提取物的质量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葛根素标准品（CAS号3681-99-0，批号201816，中国食品药品检定研究院）；甲醇为色谱纯（德国Merck公司）；其他试剂均为分析纯；水为纯化水。葛根提取物（取适量的葛根药材加8倍量水煎煮3次，过滤，合并滤液，70 ℃减压浓缩，喷雾干燥而得）。8批葛根提取物来源于两个厂家，编号为1～8。

1.2 仪器与设备

Thermofisher UltiMate 3000高效液相色谱仪（二极管阵列检测器，美国ThermoFisher公司）；Fisherbrand FB11209型超声波清洗仪（美国ThermoFisher公司），瑞士Mettler XPR2型百万分之一电子天平。

1.3 方法

1.3.1 葛根素的含量测定

（1）对照品溶液配制。精密称取葛根素对照品12.5 mg于100 mL容量瓶中，加入30%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到浓度为125 μg·mL-1葛根素对照品储备液。

（2）供试品溶液配制。精确称取混合均匀的葛根提取物样品0.1 g，置于100 mL容量瓶中，加入30%乙醇约80 mL，超声（250 W，40 Hz）处理30 min，取出，冷却至室温，加30%乙醇定容至刻度，摇匀。取上清液1 mL或5 mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，即为稀释5倍的测试液。取适量样液过0.45 μm的微孔滤膜，取续滤液，供液相色谱分析。

（3）葛根素含量测定。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定。根据对照品溶液和供试品溶液色谱图中的葛根素峰面积计算供试品中的葛根素含量。色谱柱：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（25∶75，体积比）；波长250 nm；柱温35 ℃；流速1.0 mL·min-1；进样量10 μL；理论塔板数按葛根素计不低于4 000。

1.3.2 方法学考察

（1）线性关系考察。精密称取葛根素对照品13.10 mg于100 mL容量瓶中，加入30%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到浓度为124.97 μg·mL-1对照品储备液。精密吸取葛根素对照品储备液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL和5.0 mL分别至10 mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，标准曲线工作液浓度为6.25 μg·mL-1、12.50 μg·mL-1、24.99 μg·mL-1、37.49 μg·mL-1、49.99 μg·mL-1和62.49 μg·mL-1。在规定的色谱条件下进行液相色谱分析，以峰面积对浓度制作标准曲线，求出线性回归方程。

（2）精密度试验。取1.3.1中（1）项制备的葛根素对照品溶液，重复进样6次，分别计算峰面积及保留时间的RSD值。

（3）稳定性试验。精密称取葛根提取物（批号CGG-C-A031912）0.102 8 g，并按1.3.1中（2）项条件制备供试品溶液，分别于0 d、2 d、4 d、6 d、12 d和24 d测定供试品溶液葛根素的峰面积。

（4）重复性试验。精密称取同批号葛根提取物（批号CGG-C-A031912）同一天内制备的6份供试品溶液，进行色谱测定。

（5）回收率试验。取葛根素对照品165.493 mg置于100 mL容量瓶中，加30%乙醇溶解并定容，分别吸取该对照品溶液2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL各3组，分别加入已各自精密称取同批号葛根提取物约0.05 g的9个100 mL容量瓶中，按1.3.1中（2）项条件制成供回收率测定用的供试品溶液，按1.3.1中（3）项进行测定，计算葛根素的回收率。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

以葛根素对照品浓度（µg·mL-1）为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线，求出线性回归程：Y= 0.7675X+0.049 8，R2=0.999 6。结果表明葛根素在6.25～62.49 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。结果如表1和图1所示。

表1 葛根素标准曲线试验结果表

图1 葛根素标准曲线图

2.2 精密度试验

以葛根素计，保留时间和峰面积的RSD值为0.57%和0.28%，不对称度不高于1.1，理论塔板数约6 000。表明仪器精密度良好。结果如表2所示。

表2 精密度试验结果表（n=6）

2.3 稳定性试验

稳定性试验结果显示，供试品中葛根素峰面积的RSD为0.22%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。结果如表3所示。

表3 稳定性试验结果表（n=6）

2.4 重复性试验

葛根素平均含量为15.67%，RSD为0.56%。分离度＞1.5。表明该方法重复性良好。结果如表4所示。

表4 重复性试验结果表

2.5 回收率试验

平均回收率为102.78%（95%～105%），RSD值为1.55%，表明该方法准确度良好。结果如表5所示。

表5 回收率试验结果表（n=9）

2.6 样品含量测定

8批葛根提取物中葛根素含量在11.69%～15.67%，平均值约为13.9%，其中陕西A产地的含量最高，为15.47%～15.67%；安徽A产地的含量最低，为11.69%～12.55%，相同产地不同批次的葛根素含量数据差异较小。结果如表6所示。

表6 葛根提取物葛根素含量测定结果表

3 结果与讨论

本次方法学验证表明，葛根提取物中葛根素含量的高效液相色谱法的系统适应性、精密度、线性关系、准确度等均符合要求，该方法准确、可靠，可以作为葛根提取物中葛根素的含量测定方法。从上述研究表明，不同产地的葛根提取物的葛根素含量存在一定差异。这可能与葛根药材的生长环境、采收时间、加工工艺等因素有关，有待进一步研究。